嵌合抗原受体（CAR）构建服务应用

背景及概述^[1]

嵌合抗原受体（CAR）构建服务主要包括嵌合抗原受体（CAR）的构建及体外验证等。嵌合抗原受体（CAR）疗法是一个涉及到患者T细胞基因修饰，进而诱导其攻击肿瘤细胞的一种个体化的治疗方法。在机体抗肿瘤免疫治疗中，细胞免疫发挥了十分重要的作用，但是生理性的T细胞表面受体识别肿瘤抗原的模式在很大程度上受到了人体白细胞抗原的限制，并且对肿瘤细胞人体白细胞抗原分子表达的下调与免疫抑制的肿瘤微环境，T细胞表面受体很难在其中发挥出相应的作用。MHC代表个体特异性的同种异型抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中能引起强而迅速排斥反应的抗原称主要组织相容性抗原(MHC)。近年来对免疫应答机制的研究发现，MHC的基因表达产物MHC分子在免疫应答中具有重要的生物学意义：一方面，MHC分子直接参与抗原提呈细胞(APC)对内源性或外源性抗原的提呈；另一方面，在TCＲ特异性识别APC所提呈的抗原肽过程中，必须同时识别与抗原肽结合成复合物的MHC分子，才能产生T细胞激活信号，即MHC限制性。

应用^[1]

嵌合抗原受体（CAR）构建服务相关的免疫治疗方法已经在临床上的研究已超过15a。现阶段正在进行的临床实验有30项之多，研究的内容主要包括病毒性疾病、血液系统肿瘤以及实体瘤等，特别是在血液系统的研究方面，该技术的发展十分先进。原因在于，多数血液肿瘤中都有着较为清楚的肿瘤相关抗原以及肿瘤特异性抗原，为嵌合抗原受体治疗方法提供了良好的单链以及靶点可变区。例如，对于CD123、CD30、CD22、CD20等多个靶点，已经在嵌合抗原受体疗法的研究中有所涉及。但是实体瘤能够作为设计嵌合抗原受体疗法的靶点抗原很少，在局部的肿瘤免疫抑制微环境中，其抗肿瘤效果相对较差。从CD19嵌合抗原受体所修饰的T细胞在慢性淋巴细胞白血病以及非霍奇金淋巴瘤中的发展过程看，嵌合抗原受体技术被运用得较为恰当。对于多发性脊髓瘤，嵌合抗原受体治疗方法可能会成为它的主要治疗方法，针对CD56、CD38及CD138甚至胞内肿瘤抗原，嵌合抗原受体的研究至今都处于前临床阶段，并且为临床试验提供了十分珍贵的数据。部分临床实验已经证实嵌合抗原受体修饰的T细胞能够根治AML。Ley寡糖抗原是最早被选为嵌合抗原受体治疗的AML靶点，并已经成功地进入到临床实验中。参与实验的患者的病情都在短时间内得到稳定，并且均没有出现明显的毒副反应，这充分说明了Ley寡糖抗原可以作为嵌合抗原受体T细胞的良好靶点。

构建原理^[2]

嵌合抗原受体（CAR）构建服务中嵌合抗原受体（CAR）构建与分子生物学的基因工程免疫受体有关。简单来说，就是将一个来自某一抗体的轻链和重链序列的多肽结构，连接于受体上的信号传导装置，如经典的T细胞受体——‘链，通过对其三大区域(配体结合域、跨膜结构域与胞内信号域)基本设计上的不断改进，从而提高其效能。

1）构建CARs信号域

CARs传输一个信号到细胞内的T细胞需要通过一个信号域，经典的信号域为cD3链，也有人使用来自Fc^y受体的信号域。第二、三代CARs在初代CARs信号域CD3的基础上引入新的信号域，如CD28、4—1BB或OX40，以期产生共同刺激，使TCR更易被抗原递呈细胞(APC)识别，完全激活T细胞生理活性。事实证明，引入共刺激信号分子这种方式能增加细因子的产量及促进CAR—T细胞体外增殖，第二代CD19特异性的CARs能携带CD28或4—1BB信号集团，且在临床前模型和B细胞恶性肿瘤的临床试验中已经证明其具有体内抗肿瘤活性”。目前常用的共刺激分子包括CD27、CD28、CD134(OX40)、CD137(4—1BB)、CD244和ICOS等，将其合并在一起能增加∈链信号，从而增强T细胞的增殖和存活”。

CD28是个用于构造CARs的共刺激分子，显著增加了IL一2的产物和细胞毒性，加入共刺激分子CD28后，通过调节T细胞能增加CARs对细胞毒性的抗性。临床前实验发现与CD28共刺激CARs相比，CD137的引入更能改善CARs的体内存活，增强其抗肿瘤活性I。而ICOS信号域过表达能使人T细胞转化为Thl7表型，并且在某些情况下与CD28共刺激的Thl7细胞会产生更高一级的抗肿瘤功效。已清楚地发现引入单一共刺激分子能赋予CAR—T细胞更高的存活或其他一些T细胞功能，而较单一共刺激分子相比，增加更多的共刺激分子的确增加了CAR—T细胞的特性。

2）CARs跨膜域构建

配体结合域通过铰链区与跨膜域相连，通常来源于CD8和IgG4分子。铰链对于细胞表面的CARs表达非常重要。铰链区影响scFv的韧性，从而影响其与配基的相互作用。而铰链区的长度会影响T细胞和标靶间的相互作用(取决于目标抗原标位的位置)，例如，CD22靠近细胞膜表位较远端表位相比会引起更溶胞作用。同样，越长的连接区域越能增强CARs识别NCAM和5T4等膜近端表位的能力，还有可能增加其适应性。这一发现很可能揭示了CARs修饰的细胞和靶向细胞的距离。

3）CARs结合域构建

研究表明，CAR—T细胞能识别和清除相当于自身100倍的靶向抗原，如果提高CAR—T细胞的特异性，会降低其激活的条件，扩大其治疗窗。所以说，作为与靶标结合的至关重要的特异性区域，CARs配体结合域的构建尤为重要。其构建的关键在于如何能只特异性地与靶向细胞结合而不影响其他组织器官。目前大多数已确定的肿瘤特异性抗原是那些在早期胚胎发育期正常表达，而在恶性肿瘤中被异常表达的自身抗原，例如NY—ESO1和MAGE家族抗原。近期发表在~Cell>>的一项研究中，提出提高CAR—T细胞靶向特异性和准确性的一种有效方法是改造它们，使其识别组合抗原，而Kole等利用基因工程技术改造了一种需要组合激活的T细胞回路(Tcellcircuit)。在这一回路中，改造后的T细胞需要识别2个抗原，一种合成Notch受体能识别其中一个抗原，被激活后能够诱导对应第二个抗原的CAR表达，只有在肿瘤细胞同时表达2种抗原的情况下，改造后的T细胞才会被激活，研究者将这种T细胞命名为dual—receptorANDgateTcells。

体内实验中，这些T细胞展现出精准的识别与治疗，能够区分出只拥有单个抗原的非目标肿瘤，且有效清除携带组合抗原的肿瘤。不同的临床情况需要不同的scFv、铰链、跨膜区、刺激和共刺激域。事实上，迄今仍没有一个公认的方式来构建CARs。关于CARs的设计仍然需要更多的调查和对不同恶性肿瘤的临床评估。我们也许可以运用一些简单的克隆技术替换或改进其不同组件，以便于评估和完善CARs模块化设计。虽然CARs设计仍未得到根本解决，但可喜的是，关于CARs设计的新思路却层出不穷，以其为基础的新型靶向免疫治疗技术日新月异，如T细胞受体工程T细胞(Tcellreceptor—engineeredTcells，TCR—T)、双特异性T细胞衔接器(bispecificT—cellengagers，BiTE)和嵌合抗原受体NK细胞(chimericantigenreeep．torNKcells，CAR—NK)等。这意味着CARs领域的发展将比经典的新型分子药物更为迅捷，是目前肿瘤免疫治疗中炙手可热的新贵。

主要参考资料

[1]  嵌合抗原受体(CAＲ)技术在血液肿瘤治疗中的研究进展

[2] 嵌合抗原受体构建与肿瘤治疗的研究进展