AHH-1 人外周血B淋巴细胞系的应用

背景^[1-3]

AHH-1人外周血B淋巴细胞系是一种人类白血病细胞系，来源于一名急性淋巴细胞白血病患者的外周血。该细胞系具有B淋巴细胞特异性表面标志物，如CD19、CD20、CD22等，并且能够分化为浆细胞和记忆B细胞。

AHH-1人外周血B淋巴细胞系在免疫学研究中被广泛应用，例如用于研究B淋巴细胞的增殖、分化和功能，以及用于筛选和评估抗肿瘤药物的疗效。此外，AHH-1细胞系还可以用于研究B淋巴细胞相关疾病的发病机制和治疗方法。

AHH-1人外周血B淋巴细胞系

AHH-1人外周血B淋巴细胞系细胞培养操作

1)复苏AHH-1人外周血B淋巴细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)AHH-1人外周血B淋巴细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)AHH-1人外周血B淋巴细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

AHH-1人外周血B淋巴细胞系可以用于不同剂量～（60）Coγ射线致AHH-1细胞旁效应差异表达基因的研究

利用基因芯片技术对不同剂量60Coγ射线致AHH-1细胞旁效应差异表达基因进行初步研究。研究内容

1. 研究不同剂量60Coγ射线照射人淋巴母细胞(AHH-1)及与其共同培养未照射细胞基因的差异表达。

2. 不同剂量60Coγ射线致AHH-1细胞及旁效应细胞FHIT mRNA及蛋白表达变化的研究。

3. 不同剂量60Coγ射线致AHH-1细胞及旁效应细胞PTEN mRNA表达变化的研究。

实验方法1.正常人淋巴母细胞(AHH-1)经0.5Gy和2Gy 60Coγ(0.36Gy/min)射线照射后分别与未照射正常细胞(旁效应细胞)共同培养8h;应用人cDNA芯片对旁效应细胞、直接照射细胞和正常细胞进行检测,分析差异表达基因;选取差异表达1.5倍以上的基因按照生物学过程、分子功能、细胞中组分三大功能进行聚类分析筛选基因。

2. 正常人淋巴母细胞(AHH-1)经0.5Gy和2Gy 60Coγ(0.75 Gy/min)射线照射后分别与未照射正常细胞(旁效应细胞)共同培养8h,对FHIT mRNA进行qRT-PCR,Western Blot在分子及蛋白水平进行验证,对PTEN mRNA进行实时荧光定量PCR验证。

3. 统计学方法:单样本t检验。

结果1.发现γ射线照射AHH-1及其旁效应细胞基因存在差异表达;不同剂量直接照射细胞及其旁效应细胞差异表达的基因各不相同;旁效应细胞(0.5Gy)和正常对照组比较:差异表达基因(差异在1.5倍以上)171个,其中上调56个,下调115个;旁效应细胞(2.0Gy)和正常对照组比较:差异表达基因165个,其中上调106个,下调59个;旁效应细胞细胞(0.5Gy)与直接照射细胞(0.5Gy)比较:差异表达基因226个,其中上调161个,下调65个;旁效应细胞(2.0Gy)与直接照射细胞(2.0Gy)比较:差异表达基因365个,其中上调177个,下调188个;直接照射细胞(2.0Gy)与直接照射细胞(0.5Gy)比较:差异表达基因397个,其中上调309个,下调88个;旁效应细胞(2.0Gy)与旁效应细胞(0.5Gy)比较:差异表达基因222个,其中上调197个,下调25个。

经聚类分析后发现:旁效应细胞(0.5Gy)和正常对照组比较:差异表达基因20个;旁效应细胞(2.0Gy)和正常对照组比较:差异表达基因18个;旁效应细胞(0.5Gy)和直接照射组(0.5Gy)比较:差异表达基因12个;旁效应细胞(2.0Gy)和直接照射组(2.0Gy)比较:差异表达基因19个。这些差异表达的基因涉及到信号转导、细胞周期调节、免疫球蛋白、DNA修复等基因。

同时也发现了3个在各个样本中都有变化的基因。另外,热休克60kDa蛋白1(heatshock 60kDa protein 1,HSPD1)基因表达在0.5Gy及2.0Gy旁效应细胞,0.5Gy照射细胞均上调,而在2.0Gy照射细胞中下调。

2.直接照射及旁效应细胞的FHIT基因表达呈下降趋势,但变化不显著(P>0.05)。FHIT蛋白表达水平结果表明直接照射及旁效应细胞的FHIT蛋白表达均呈下降趋势,照射剂量为0.5Gy时,其变化不显著;随照射剂量的增加,FHIT蛋白表达下降趋势显著,尤其是照射剂量达2.0Gy以上时,FHIT蛋白表达显著下降,存在比较明显的剂量依赖性。将旁效应细胞与直接照射细胞进行比较,其下降幅度不如直接受照细胞显著。

参考文献

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[2]Activation of mitogen-activated protein kinases is essential for hydrogen peroxide-induced apoptosis in retinal pigment epithelial cells.T.-C.Ho;Y.-C.Yang;H.-C.Cheng;A.-C.Wu;S.-L.Chen;H.-K.Chen;Y.-P.Tsao.Apoptosis,2006

[3]The Involvement of Calcium and MAP Kinase Signaling Pathways in the Production of Radiation-Induced Bystander Effects.F.M.Lyng;;P.Maguire;;B.McClean;;C.Seymour;;C.Mothersill.Radiation Research,2006

[4]5′CpG island hypermethylation and aberrant transcript splicing both contribute to the inactivation of the FHIT gene in resected non-small cell lung cancer.Ching Tzao;;Hui-Yuan Tsai;;Jung-Ta Chen;;Chih-Yi Chen;;Yi-Ching Wang.European Journal of Cancer,2004

[5]杨剑.不同剂量～（60）Coγ射线致AHH-1细胞旁效应差异表达基因的研究[D].第二军医大学,2008.