虾碱性磷酸酶的应用

背景及概述^[1]

正磷酸酶，又称正磷酸单酯水解酶，是一种能催化各种含磷化合物水解的酶类，根据它们起催化作用的最适pH特性，又可分为酸性磷酸酶(EC 3.1.32)和碱性磷酸酶(EC3.1.31)两类。磷酸酶具有非常重要的生理功能，它广泛存在于各种动物体内，是动物体内重要的解毒体系，并且在动物机体的骨化过程及在磷化物和其它一些营养物质的消化、吸收和转运过程中都起着重要作用。虾碱性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)催化DNA和RNA 的5’和3’磷酸单脂的去磷酸化反应，也可水解核糖和脱氧核糖核苷三磷酸（NTP 和 dNTP）。该酶在分子生物学研究中应用广泛，如去除DNA和RNA 末端的磷酸基团，用于后续的克隆和探针末端标记。在克隆中，载体经虾碱性磷酸酶去磷酸化后因5’ 端无磷酸基团，因而不可以和自身3’ 端连接。虾碱性磷酸酶可作用于5’突出端、凹陷端和平末端，也可用来降解PCR反应中的游离dNTP，用于制备测序模板和SNP分析。该虾碱性磷酸酶在65℃温育5分钟即可完全的、不可逆的失活，因此，在连接或末端标记之后，可以不用去除。基于以上特性，该酶是传统去磷酸化酶--小牛肠碱性磷酸酶的绝佳替代物。

组分

应用^[1]

DNA 和 RNA 的去磷酸化;

防止克隆载体的自连;

制备5´末端标记模板;

去除 PCR 产物中的 dNTP 和焦磷酸盐。

活性定义

1单位指在25℃条件下，30分钟能使1μg经 HindIII（产生5’突出末端）消化的 pUC19 DNA 去磷酸化所需的酶量。去磷酸化标准是指在自连接反应中能抑制＞95%的DNA 再连接。

储存

-20℃可保存3年。

使用注意事项

（1）1×SAP Buffer：50 mM Bis-Tris HCl pH 6.0，1mM MgCl2，0.1 mM ZnCl2，25℃ 温育。

（2）热失活：65℃ 加热 5 分钟，不可逆失活。该酶通常用于酶切载体的去磷酸化，因其不可逆热失活特性。当完成去磷酸化反应后，无需再纯化产物，可以直接用于后续连接反应。

（3）虾碱性磷酸酶也可以用来降解PCR反应中的游离dNTP，用于制备测序模板和 SNP 分析。同样无需纯化，可直接用于下游实验。

主要参考文献

[1] 何海琪, 孙凤. 中国对虾酸性和碱性磷酸酶的特性研究[D]. , 1992.