大鼠脑动脉平滑肌细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠脑动脉平滑肌细胞分离自脑动脉组织；脑动脉有成对的颈内动脉和椎动脉互相衔接成动脉循环；静脉系多不与同名动脉拌行，所收集的静脉血先进入静脉窦再汇入颈内静脉；各级静脉都没有瓣膜。它包括脑的动脉系统和脑的静脉系统。

大鼠脑动脉平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。

大鼠脑动脉平滑肌细胞

大鼠脑动脉平滑肌细胞使用方法

大鼠脑动脉血管平滑肌细胞是一种贴壁细胞，细胞形态呈成纤维细胞样，在澳睿赛技术部标准操作流程下，可传5代左右；3代以内状态；建议您收到细胞后尽快进行相关实验。

客户收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1.取出T25细胞培养瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。

2.贴壁细胞消化

1)吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至T25培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养基终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按传代比例接种T25培养瓶传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察；之后按照换液频率更换新鲜的完全培养基。

3.大鼠脑动脉平滑肌细胞收货脱落

1)收集所有细胞悬液，1000rpm，离心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%胰蛋白酶消化液0.5mL至离心管中，重悬沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱静置5-7min)；消化完向离心管内加入5ml完全培养基终止消化；

3)经1000rpm，离心5min，丢弃上清，用5ml完全培养基(补加1%FBS，促进贴壁)重悬沉淀，接种于新的培养瓶内；

4)待细胞完全贴壁后，培养观察；之后按照换液频率更换新鲜的完全培养基(37℃预热)。

4.大鼠脑动脉平滑肌细胞实验

因原代细胞贴壁特殊性，贴壁的原代细胞在消化后转移至其他实验器皿（如玻璃爬片、培养板、共聚焦培养皿等）时，需要对实验器皿进行包被，以增强细胞贴壁性，避免细胞因没贴好影响实验；包被条件常选用鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2），多聚赖氨酸PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%），依据细胞种类而定。悬浮/半悬浮细胞无需包被。

应用^[4-5]

大鼠脑动脉平滑肌细胞可以用于异甘草素对自发性高血压大鼠脑基底动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用

研究异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)对自发性高血压大鼠(Spontaneously hypertension rats,SHR)脑基底动脉血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)大电导钙激活钾通道(Large conductance Ca-activated K 2++channel,BKCa)的调节作用。

方法:在使用异甘草素干预处理前后,用尾动脉测压仪观察SHR血压变化;依次用10-5mol/L苯肾上腺素(phenylephrine,PE)、10-5 mol/L苯肾上腺素和10-4 mol/L异甘草素、10-5mol/L苯肾上腺素分别对SHR脑基底动脉灌流后,脑基底动脉的直径应用压力型小动脉仪进行测量;用全细胞膜片钳技术研究SHR脑基底动脉平滑肌细胞(VSMC)BKCa通道电流的变化;用ELISA技术观察SHR脑基底动脉内c GMP水平变化。

结果:(1)ISL干预前SHR血压是(218.3±1.6)mm Hg,与WKY血压(119±2.1)mm Hg相比,两者具有显著统计学差异(p<0.01,n=6)。与ISL干预前相比,ISL灌胃(12mg/kg.d)14天后SHR血压降至(119.2±1.9)mm Hg(p<0.01,n=6),但与WKY血压没有明显差异;

(2) 含有PE(10-5 mol/L)的PSS液体在压力型小动脉测量仪水浴槽内持续对血管段进行灌流,待血管段收缩状态稳定后,再用含有ISL(10-4 mol/L)和PE(10-5 mol/L)的PSS液体持续灌流冲洗,血管舒张达到稳定状态后,给予含PE(10-5 mol/L)的PSS液体再次持续灌流冲洗,记录血管直径分别为:(235.6±26)μm、(309.2±25)μm和(241.1±27)μm,提示ISL舒张SHR脑基底动脉(n=6,p<0.01);

(3) 单个脑基底动脉平滑肌细胞钳制电压在-40 m V,外向电流在刺激电压-40-20 m V区间内无显著变化,10-4 mol/L ISL在0-60 m V区间内可以呈电压依赖性增强脑基底动脉平滑肌细胞外向电流(n=6,p<0.05);

(4) 在0、10-7、10-6、10-5、10-4和3×10-4 mol/L异甘草素作用下,平滑肌细胞+60m V时的外向电流分别是(144±25)p A、(156±24)p A、(173±24)p A、(211±21)p A、(252±21)p A和(262±20)p A。除10-7 mol/L异甘草素组和对照组没有明显差异外,其余各组均呈浓度依赖性增强外向电流,提示ISL呈浓度依赖性增强脑基底动脉平滑肌细胞外向电流(n=6,p<0.05),且增强平滑肌细胞外向电流的EC50为9.5μmol/L;

(5)异甘草素干预后的SHR平滑肌细胞外向电流(+60m V)从(212.1±32)p A增加到(283.2±28)p A(p<0.01,n=6),用10-3 mol/L四乙胺(TEA,BKCa通道阻断剂)灌流3min后,SHR平滑肌细胞在+60m V时的外向电流减小到(143.4±21)p A(p<0.05,n=6)。

该结果提示异甘草素增强的平滑肌细胞外向电流由BKCa通道介导;(6)预灌流10-5 mol/L亚甲蓝(MB,可溶性鸟苷酸环化酶阻断剂)3min后,异甘草素增强的平滑肌细胞外向电流(+60m V)从(324.3±74)p A减小到(171.9±42)p A(p<0.05,n=6),与对照组(163.9±43)p A相比没有统计学差异。

参考文献

[1]Pathophysiology of Hypertension in the Absence of Nitric Oxide/Cyclic GMP Signaling.Robrecht Thoonen;;Patrick Y.Sips;;Kenneth D.Bloch;;Emmanuel S.Buys.Current Hypertension Reports,2013

[2]Effects of cyclic GMP elevation on isoprenaline‐induced increase in cyclic AMP and relaxation in rat aortic smooth muscle:role of phosphodiesterase 3.Eric Delpy;;HervéCoste;;Anne‐Charlotte le Monnier Gouville.British Journal of Pharmacology,2012

[3]Amplified NO/cGMP‐mediated relaxation and ryanodine receptor‐to‐BKCa channel signalling in corpus cavernosum smooth muscle from phospholamban knockout mice.ShreenaJoshi;Mark TNelson;Matthias EWerner.British Journal of Pharmacology,2011

[4]Large conductance,Ca 2+-activated K+channels(BK Ca)and arteriolar myogenic signaling.Michael A.Hill;;Yan Yang;;Srikanth R.Ella;;Michael J.Davis;;Andrew P.Braun.FEBS Letters,2010

[5]田伟伟.异甘草素对自发性高血压大鼠脑基底动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用[D].石河子大学,2016.