人类鳞状上皮舌癌细胞的应用

背景^[1-3]

人类鳞状上皮舌癌细胞来自25岁男性的舌头鳞状细胞癌组织，表皮角蛋白;低水平的整合素，皮下接种了107个细胞的裸鼠在21天内以100％的频率（5/5）出现了肿瘤。

人类鳞状上皮舌癌细胞

人类鳞状上皮舌癌细胞培养步骤：

一．人类鳞状上皮舌癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

准备DMEM/F12培养基；优质胎牛血清，10%；400ng/mL氢化可的松,双抗，1%。

1）注意事项：

（a）在细胞生长的初始阶段，细胞以贴壁的形式生长并呈现出长方体的形态和有“伪足”延伸。随着培养时间的增加，细胞呈现圆形并以叠加的形式生长。细胞密度达到一定的程度，会有细胞以悬浮的方式散落到到培养基中，镜下观察会发现悬浮和贴壁的细胞会同时出现。

（b）该细胞传代时不需要用胰酶消化。传代时，用无菌细胞刮刮拭培养表面将细胞刮落，收集离心后重悬接种到新的培养瓶中。

（c）该细胞形态上包含松散贴壁的纺锤形和圆形或者立方形。当细胞密度较大时，细胞会轻微脱落变圆或者许多细胞堆积在一起，有些细胞甚至脱落漂浮。这些漂浮的细胞是存活的，在传代时应收集起来，离心后细胞沉淀可以继续培养。

（d）血清质量差异可能引起细胞贴壁能力变化，应选用高质量的胎牛血清。

2）人类鳞状上皮舌癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度

3）人类鳞状上皮舌癌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．人类鳞状上皮舌癌细胞处理：

1）冻存人类鳞状上皮舌癌细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）人类鳞状上皮舌癌细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

该细胞为悬浮和轻微的贴壁细胞，传代可以参考以下方法：该细胞用细胞刮铲替代胰酶来对细胞进行处理。用无菌细胞刮铲刮拭细胞附着培养表面将细胞刮落，收集细胞后离心去上清，重悬后接种到新的装有新鲜培养液的培养瓶内。收货后次传代1:2进行，后续可以根据实际的情况以1:2~1:4的比例进行传代。

3）人类鳞状上皮舌癌细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1.1，细胞用细胞刮铲替代胰酶来对细胞进行处理。用无菌细胞刮铲刮拭细胞附着培养表面将细胞刮落，收集细胞。

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4][5]

人类鳞状上皮舌癌细胞可以用于青蒿素及其衍生物逆转人口腔鳞状上皮癌细胞体外实验研究

以耐药的人口腔鳞状上皮癌细胞系(KBV200)为靶细胞,以青蒿素、二氢青蒿素、青蒿琥酯及青蒿提取物(乙醇粗提物)为实验药物,通过体外细胞孵育技术观察其逆转KBV200细胞的耐药效应。

方法：采用MTT法分别测定长春新碱(VCR)、青蒿素、二氢青蒿素、青蒿琥酯及青蒿提取物(乙醇粗提物)对KBV200细胞毒作用,计算相应的IC50,并以上述药物对KBV200的抑制率<30﹪的实验用药浓度与VCR配伍使用时对VCR细胞毒效应(IC50),依据公式计算实验用药的增敏指数。

结果研究结果表明:①二氢青蒿素、青蒿琥酯在体外细胞培养条件下,能够明显抑制KBV200细胞的增殖,其IC50分别为11.16μmol/l(3.18μg/ml)、1.466μmol/l(0.563μg/ml);

②在体外细胞培养条件下,青蒿素、青蒿提取物(乙醇粗提物)浓度分别为40umol/l、8.88μg/ml与17.75μg/ml时,与VCR配伍使用后逆转耐药倍数为3.0倍、2.98倍与12.74倍。以上证明两种成分均可部分逆转KBV200细胞耐药性,且与用药剂量呈正相关性。

结论该项研究在国内首次发现,在体外细胞孵育条件下,青蒿素与青蒿提取物(乙醇粗提物)能够部分逆转KBV200细胞的耐药性;二氢青蒿素和青蒿琥酯能够抑制KBV200细胞增殖,且青蒿琥酯作用更为明显。研究结果证明,青蒿提取物及其活性成分(衍生物)在抗肿瘤与逆转肿瘤多药耐药领域具有潜在的研究价值和临床应用前景。

参考文献

[1]Signaling pathway cooperation in TGF-β-induced epithelial–mesenchymal transition.Rik Derynck;;Baby Periyanayaki Muthusamy;;Koy Y Saeteurn.Current Opinion in Cell Biology,2014

[2]Clinical significance of epithelial-mesenchymal transition.Konrad Steinestel;;Stefan Eder;;Andres Jan Schrader;;Julie Steinestel.Clinical and Translational Medicine,2014

[3]Cancer stem cells and radioresistance.Kiera Rycaj;;Dean G.Tang.International Journal of Radiation Biology,2014

[4]Prognostic impact of cancer stem cell-related markers in non-small cell lung cancer patients treated with induction chemoradiotherapy.Kazuhiko Shien;;Shinichi Toyooka;;Kouichi Ichimura;;Junichi Soh;;Masashi Furukawa;;Yuho Maki;;Takayuki Muraoka;;Norimitsu Tanaka;;Tsuyoshi Ueno;;Hiroaki Asano;;Kazunori Tsukuda;;Masaomi Yamane;;Takahiro Oto;;Katsuyuki Kiura;;Shinichiro Miyoshi.Lung Cancer,2012

[5]吕翠岩.青蒿素及其衍生物逆转人口腔鳞状上皮癌细胞体外实验研究[D].北京中医药大学,2006.