人宫颈癌肠转移细胞的应用

背景^[1-3]

人宫颈癌肠转移细胞是从小肠肠系膜转移灶的细胞中建立的。据报道，它含有完整的HPV-16(每个细胞大约600个拷贝)和HPV-18相关序列。

人宫颈癌肠转移细胞

人宫颈癌肠转移细胞培养步骤:

一．人宫颈癌肠转移细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）RPMI-1640+10%FBS+1%P/S

2）人宫颈癌肠转移细胞培养条件：Atmosphere:Air,95%;CO2,5%，Temperature:37℃。

3）人宫颈癌肠转移细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

4）Gene Expression：beta subunit of human chorionic gonadotropin(hCG);tumor associated antigen

二．人宫颈癌肠转移细胞处理：

1）复苏人宫颈癌肠转移细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人宫颈癌肠转移细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人宫颈癌肠转移细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人宫颈癌肠转移细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将人宫颈癌肠转移细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

人宫颈癌肠转移细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1．人宫颈癌肠转移细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人宫颈癌肠转移细胞可以用于毛钩藤碱对人宫颈癌Ca Ski细胞增殖、凋亡、转移及侵袭的影响

探讨毛钩藤碱对人宫颈癌Ca Ski细胞增殖、凋亡、转移、侵袭的影响及机制。

方法:细胞活性与增殖检测(CCK-8)法检测细胞增殖活性,Hoechst 33258染色及流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链式反应检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),p53 mRNA表达,划痕实验检测细胞转移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测纤连蛋白(FN),基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测蛋白表达。

结果:与空白组比较,毛钩藤碱可以呈剂量及时间依赖性的抑制Ca Ski细胞的增殖;8.0,16.0,32.0μmol·L-1毛钩藤碱组细胞凋亡率,Bax,p53 mRNA表达增加(P<0.05,P<0.01),Bcl-2 mRNA及磷酸化Src(p-Src),磷酸化信号转导和转录活化因子3(p-STAT3)蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,1.0,2.0,4.0μmol·L-1毛钩藤碱组细胞迁移率,穿膜细胞数,FN,MMP-2,MMP-9含量及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α),波形蛋白(Vimentin),N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达降低(P<0.05,P<0.01),E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达增加(P<0.01)。

结论:毛钩藤碱可以抑制人宫颈癌Ca Ski细胞的增殖、转移及侵袭,并能诱导凋亡,作用机制与调控Src/STAT3及HIF-1α/上皮间充质转化(EMT)信号通路有关。

参考文献

[1]Long non-coding RNA PTAR inhibits apoptosis but promotes proliferation,invasion and migration of cervical cancer cells by binding miR-101.[J].Wang Xuehe;Sun Huaqin;Zhu Simin.Bioengineered,2021(1)

[2]Trichosanthin inhibits cervical cancer by regulating oxidative stress-induced apoptosis.[J].Zhu Chenglu;Zhang Cuilan;Cui Xiaoming;Wu Jing;Cui Zhizhu;Shen Xiaojuan.Bioengineered,2021(1)

[3]The Outcome of Locally Advanced Cervical Cancer in Patients Treated with Neoadjuvant Chemotherapy Followed by Radical Hysterectomy and Primary Surgery.[J].Mousavi Azamsadat;Modarres Gilani Mitra;Akhavan Setareh;Sheikh Hasani Shahrzad;Alipour Abbas;Gholami Hamideh.Iranian journal of medical sciences,2021(5)

[4]The role of lymph nodes in cervical cancer:incidence and identification of lymph node metastases-a literature review.[J].Olthof Ester P;van der Aa Maaike A;Adam Judit A;Stalpers Lukas J A;Wenzel Hans H B;van der Velden Jacobus;Mom Constantijne H.International journal of clinical oncology,2021(9)

[5]李亚威,谢磊,王娜.毛钩藤碱对人宫颈癌Ca Ski细胞增殖、凋亡、转移及侵袭的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(04):109-115.