人抗SA抗体(ANTI-SA-AB)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人抗SA抗体(ANTI-SA-AB)ELISA KIT用于体外定量检测人血清、血浆或其它相关生物液体中抗SA抗体(ANTI-SA-AB)浓度。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗SA抗体(ANTI-SA-AB)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的抗SA抗体(ANTI-SA-AB)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗SA抗体(ANTI-SA-AB)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗SA抗体(ANTI-SA-AB)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中抗SA抗体(ANTI-SA-AB)的浓度。

人抗SA抗体(ANTI-SA-AB)ELISA KIT

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于抗Sa、CCP抗体、GPI抗原和RF联合检测对RA诊断的意义研究

探讨抗Sa抗体、抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体、GPI抗原及类风湿因子联合检测对类风湿关节炎诊断的意义。

方法:（1）采用ELISA法对确诊为RA的患者97例、其他自身免疫疾病组67例及健康对照组49例人群的抗Sa抗体、抗CCP抗体、GPI抗原及RF亚型RF-IgA、RF-IgG、RF-IgM进行检测，免疫比浊法检测RF。

（2）记录同期患者相关临床资料及实验室指标，包括年龄、性别、晨僵时间、疼痛肿胀关节数、血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、抗核抗体（ANA）、DAS28。

结果:（1）抗Sa抗体、抗CCP抗体、GPI、RF及RF亚型RF-IgA、RF-IgG、RF-IgM的特异性和敏感性分别是95.69%和59.79%、98.28%和90.72%、76.14%和78.35%、67.24%和91.75%、89.66%和58.76%、90.52%和68.04%、79.31%和79.38%。

（3）RF阴性的RA患者中抗Sa抗体、抗CCP抗体、GPI抗原的阳性率分别为25.0%、50.0%、50.0%。

（4）两种及以上指标联合检测的特异性和敏感性分别是：两种指标联合检测为92.24%-100%和47.42%-86.60%；三种指标联合检测为99.14%-100%和46.39%-71.13%；四种指标联合检测为100%和46.39%。

（5）抗Sa抗体阳性组中C-反应蛋白大于阴性组（P＜0.05）。

（6）GPI在RA活动组和非活动组中测得的浓度有显著性差异（P＜0.05）。

结论:两种及以上指标联合检测可以显著提高RA的诊断特异性，有利于RA的早期诊断及治疗。

参考文献

[1]Autoantibodies in rheumatoid arthritis:a review[J].D.Mewar,A.G.Wilson.Biomedicine＆Pharmacotherapy.2006(10)

[2]Rheumatoid factor on a daily basis[J].Yves Renaudineau,Christophe Jamin,Alain Saraux,Pierre Youinou.Autoimmunity.2005(1)

[3]Glucose-6-phosphate isomerase variants play a key role in the generation of anti-GPI antibodies:possible mechanism of autoantibody production[J].Yoshifumi Muraki,Isao Matsumoto,Yusuke Chino,Taichi Hayashi,Eiji Suzuki,Daisuke Goto,Satoshi Ito,Hideyuki Murata,Akito Tsutsumi,Takayuki Sumida.Biochemical and Biophysical Research Communications.2004(2)

[4]Rheumatoid arthritis specific anti-Sa antibodies target citrullinated vimentin.ER Vossenaar,N Despres,E Lapointe,van der Heijden A,M Lora,T Senshu,van Venrooij WJ,HA Menard.Arthritis research＆therapy.2004

[5]王爱雪.抗Sa、CCP抗体、GPI抗原和RF联合检测对RA诊断的意义[D].石河子大学,2013.