人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)ELISA试剂盒用于检测血液、血清、胸腹水等其他体液中受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)的含量。

实验原理：人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)ELISA试剂盒

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于RIPK2介导自噬对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞ROS-NLRP3炎症小体信号的调控研究

通过观察小鼠肾系膜细胞中RIPK2、LC3II/I、ROS、Caspase1、IL-1β在不同时间及不同浓度高糖干预下的表达变化,同时检测细胞培养上清液中IL-1β表达,再通过细胞转染RIPK2-siRNA干扰RIPK2后再次观察自噬水平及ROS-NLRP3炎症小体关键因子的改变,旨在探讨高糖对肾系膜细胞RIPK2、自噬的影响以及自噬对ROS-NLRP3炎症小体信号通路的调控作用,为DN的防治提供新的思路。

方法:1.细胞培养及分组:体外培养小鼠肾小球系膜细胞（SV40）,以高糖作为刺激因素,分为以下三组:（1）正常对照组（Normal control group,NC组）:培养基含5.6 mmol/L葡萄糖;（2）渗透压对照组（Osmotic pressure group,OP组）:培养基含5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇。（3）不同高糖浓度干预组（High glucose group,HG组）:培养基分别含10 mmol/L葡萄糖（HG1组）、20 mmol/L葡萄糖（HG2组）、30 mmol/L葡萄糖（HG3组）;

2.各组细胞培养0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h后,用Western-blot检测RIPK2、LC3II/I、Caspase1、IL-1β的蛋白表达;RT-PCR检测RIPK2、Caspase1、IL-1βmRNA表达;mRFP-GFP-LC3融合蛋白的腺病毒标记LC3以观察自噬流;各组细胞适时随机加入处理因素后装载2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐探针（2’,7’-Dichlorofluorescin Diacetate,DCFH—DA）,并用分光光度计检测细胞内ROS水平变化;ELISA检测培养上清液IL-1β浓度。

3.RIPK2的siRNA干扰研究:筛选出高糖作用浓度（30mmol/L）和时间（12h）后,细胞转染RIPK2 siRNA,再次进行分组:（1）siNC组:细胞转染control siRNA加入含5.6 mmol/L葡萄糖培养基培养12h;（2）si RIPK2组:细胞转染RIPK2siRNA加入含5.6 mmol/L葡萄糖培养基培养12h;（3）HG+siNC组:细胞转染control siRNA加入含30 mmol/L葡萄糖培养基培养12h;（4）HG+siRIPK2组细胞转染RIPK2 si RNA加入含30 mmol/L葡萄糖培养基培养12h;再次采用Western-blot、RT-PCR、mRFP-GFP-LC3标记+共聚焦显微镜、DCFH—DA标记+分光光度计及ELISA等方法检测上述指标。

4.统计学分析:采用SPSS 24.0统计软件对数据进行处理分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（?）表示,采用单因素方差分析对多组间均数进行比较,组间多重比较用LSD—t法。我们定义P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果:（1）与NC组相比,高糖刺激可增加细胞内ROS产量、Caspase1、IL-1β蛋白及mRNA表达,差异均具有统计学意义（P值均＜0.05）,且具有时间及浓度依赖性。

（2）与NC组相比,高糖在短期作用时间内（0-12h）可诱导RIPK2、LC3II/I蛋白及RIPK2mRNA表达（P＜0.05）,且在30 mmol/L高糖作用12h条件下表达显著增强,超过12h作用时间后RIPK2及LC3II/I表达下调（P＜0.05）。

（3）细胞转染RIPK2 siRNA后成功抑制RIPK2表达。与siNC组相比,siRIPK2组LC3II/I表达显著下调,而细胞内ROS产量、Caspase1及IL-1β蛋白表达则显著增加（P＜0.05）。

参考文献

[1]The NLRP3 inflammasome in kidney disease and autoimmunity[J].Holly L Hutton,Joshua D Ooi,Stephen R Holdsworth,A Richard Kitching.Nephrology.2016(9)

[2]Impaired Podocyte Autophagy Exacerbates Proteinuria in Diabetic Nephropathy[J].Atsuko Tagawa,Mako Yasuda,Shinji Kume,Kosuke Yamahara,Jun Nakazawa,Masami Chin-Kanasaki,Hisazumi Araki,Shin-ichi Araki,Daisuke Koya,Katsuhiko Asanuma,Eun-Hee Kim,Masakazu Haneda,Nobuyuki Kajiwara,Kazuyuki Hayashi,Hiroshi Ohashi,Satoshi Ugi,Hiroshi Maegawa,Takashi Uzu.Diabetes.2016(3)

[3]Sirt1 is essential for resveratrol enhancement of hypoxia-induced autophagy in the type 2 diabetic nephropathy rat[J].Liqun Ma,Rongguo Fu,Zhaoyang Duan,Jiamei Lu,Jie Gao,Lifang Tian,Zhian Lv,Zhao Chen,Jin Han,Lining Jia,Li Wang.Pathology-Research and Practice.2016

[4]High Glucose and Lipopolysaccharide Prime NLRP3 Inflammasome via ROS/TXNIP Pathway in Mesangial Cells[J].Hong Feng,Junling Gu,Fang Gou,Wei Huang,Chenlin Gao,Guo Chen,Yang Long,Xueqin Zhou,Maojun Yang,Shuang Liu,Shishi Lü,Qiaoyan Luo,Yong Xu,Paolo Fiorina.Journal of Diabetes Research.2016

[5]陈娇.RIPK2介导自噬对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞ROS-NLRP3炎症小体信号的调控研究[D].西南医科大学,2017.