NCI-H1395人肺腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

NCI-H1395人肺腺癌细胞源自一名55岁白人女性肺腺癌患者，患者有15年吸烟史，每年吸烟15包。NCI-H1395细胞系于1986年4月建立。NCI-H1395细胞表现为上皮样形态，贴壁生长。

除了NCI-H1395细胞系外，还有一株名为NCI-BL1395[BL1395]的细胞系，来源于同一患者的类淋巴母细胞。该患者可能同时患有与淋巴系统相关的疾病。

NCI-H1395人肺腺癌细胞

NCI-H1395细胞特性：

上皮细胞样：NCI-H1395细胞呈现上皮细胞的形态特征；

贴壁生长：这些细胞是贴壁生长型，会附着在培养容器表面生长；

NCI-BL1395是另一株来源于同一患者的类淋巴母细胞。

NCI-H1395细胞传代步骤：

当NCI-H1395细胞生长至80-90%汇合度时进行传代。

1.吸出旧培养基。

2.用PBS轻轻冲洗NCI-H1395细胞1-2次，以去除残留血清。

3.加入适量0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37°C孵育2-3分钟。

4.轻轻拍打培养瓶，观察NCI-H1395细胞是否脱落。

5.加入含血清的完全培养基终止消化。

6.将NCI-H1395细胞悬液转移到离心管中，1000rpm离心5分钟。

7.弃上清，用新鲜培养基重悬NCI-H1395细胞。

8.按1:3或1:4的比例将NCI-H1395细胞接种到新的培养瓶中。

NCI-H1395细胞冻存

冻存液配方：55%基础培养基+40%FBS+5%DMSO

将NCI-H1395细胞悬浮在冻存液中，缓慢降温后转移至液氮中长期保存。

NCI-H1395细胞复苏

从液氮中取出NCI-H1395细胞，在37°C水浴中快速解冻。

将NCI-H1395细胞悬液转移到含预热完全培养基的培养瓶中。

24小时后更换新鲜培养基，去除DMSO。

注意事项

无菌操作：所有操作需在无菌条件下进行，避免细菌、真菌等微生物污染。

培养基选择：使用RPMI-1640基础培养基，添加10%FBS和1%P/S。

培养基成分：特定实验条件下，可能需要添加特定的细胞因子或添加物。

细胞来源信息：了解NCI-H1395细胞的来源背景有助于研究结果的解释。

质量控制：定期进行支原体检测，每3-4个月进行一次STR鉴定，确保NCI-H1395细胞系的真实性和纯度。

培养过程监控：定期观察NCI-H1395细胞形态和生长状态，及时发现并解决培养过程中的问题。

应用^[4][5]

NCI-H1395人肺腺癌细胞可以用于肺癌细胞来源的外泌体中microRNA差异性分析

通过对不同类型肺癌细胞和正常肺上皮细胞分泌外泌体中micro RNA的提取,统计分析得到差异性的micro RNA,从而筛查出外泌体与肺癌的诊断和转移具有相关性的micro RNA,拟为肺癌的临床诊断与治疗提供以micro RNA为代表的分子标记物。

方法:从中科院上海生命科学研究院细胞资源中心购买三种肺癌细胞95D(人高转移肺癌细胞)、HCC827(人非小细胞癌)、NCI-H1395人肺腺癌细胞以及HBE(正常肺上皮细胞)。然后对不同类型肺癌细胞及正常细胞进行离心后贴壁法培养细胞,肺癌细胞培养仪器和设备为美国Gibco公司的RPMI-1640培养基、胎牛血清FBS(10%)、双抗(青霉素和链霉素)(1%)、Sigma公司的0.25%胰酶-0.02%EDTA和日本SANYO公司MCO-20AIC二氧化碳恒温培养箱;正常细胞培养仪器和设备为美国Gibco公司的DMEM低糖培养基、胎牛血清FBS(10%)、双抗(青霉素和链霉素)(1%)、Sigma公司的0.25%胰酶-0.02%EDTA和日本SANYO公司MCO-20AIC二氧化碳恒温培养箱。

NCI-H1395人肺腺癌细胞细胞传代培养方法如下:吸出旧的培养;PBS冲洗2次,每次2ml;消化:用1ml0.25%胰酶-0.02%EDTA进行消化;终止消化:加入4ml培养基终止消化;吹打;1000g5min离心;弃上清,加新的培养基,分别接种于新的培养瓶中。细胞传代培养后收集不同类型细胞培养基,保证收集过程无菌无污染,将收集到的条件培养基冻存于-80℃冰箱(<1个月),当收集至500ml时,统一解冻(4℃下)。接着进行超速离心法分离提取外泌体,方法如下:在2000g的离心力条件下持续离心20min,留上清;在10000g的离心力条件下持续离心30min,留上清;用0.22μm的滤膜进行超滤;再在100000g的离心力条件下持续离心70min,弃上清;用PBS对每只离心管沉淀进行重悬后,集中于一只离心管中,补足PBS后再次离心。滤纸吸出残留管壁的PBS后,用200ul的PBS对沉淀进行重悬(残留约50ul液体)。最后对外泌体浓度用bca试剂盒进行测定,用RNA质检、加poly(A)尾、生物素标记、杂交、洗染和扫描等方法基因芯片处理micro RNA,以对比基因之间的差异性。结果:透射电镜观察到超速离心后的溶液富含直径30-100nm的囊泡结构,最小直径38nm,最大直径100nm,总体直径平均值95%的可信区间为(72.613±3.845nm)。经提取外泌体中的micro RNA,对比三种肺癌细胞外泌体与正常肺上皮细胞外泌体中的micro RNA成分差异。

结果如下:HCC827(人非小细胞肺癌细胞-腺癌)与HBE(正常肺上皮细胞)相比,上调micro RNA数为36,下调micro RNA数为26,95D(人高转移肺癌细胞)与HBE(正常肺上皮细胞)相比,上调micro RNA数为60,下调micro RNA数为22;NCI-H1395人肺腺癌细胞与HBE(正常肺上皮细胞)相比,上调micro RNA数为295,下调micro RNA数为25。三种肺癌细胞外泌体中micro RNA对比正常细胞均有上调10倍以上的micro RNA共有3种,分别是hsa-mi R-3960,hsa-mi R-6729-5p,hsa-mi R-6090;对比正常细胞均有上调5倍以上的micro RNA共有4种,分别是hsa-mi R-6803-5p,hsa-mi R-6087,hsa-mi R-638,hsa-mi R-6089;对比正常细胞均有下调10倍以上的micro RNA有1种,是hsa-mi R-155-5p。

参考文献

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