人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒是一种通过酶联免疫技术（Elisa）原理特异性识别样本中人钙结合蛋白(CR)的商品化试剂盒。人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒可以通过识别样本中人NOD样受体(NLR)的类别及含量为科研及临床诊断提供依据。

需要注意的是若用于临床诊断的Elisa试剂盒需取得上市所在国的医疗器械资质。同时人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒的诊断结论存在一定的局限性，受限于样本保存不当、实验操作不规范，方法学灵敏度等原因不能作为临床判断的唯一依据。

钙结合蛋白（calcium-binding protein），多种具有结合钙离子能力的特殊蛋白质的总称，为一些特异性、具高亲和力或高亲和量、能可逆地与钙相结合的蛋白质。如肠道吸收钙与钙结合的蛋白质、肾脏吸收钙与钙结合的蛋白质，肌肉结合钙的蛋白质、调节代谢的钙调蛋白，甚至淀粉酶、嗜热菌蛋白质等。

人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒

人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒技术原理：ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA(酶联免疫吸附试验,酶联免疫试剂盒)方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒样品收集、处理及保存方法:

1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒操作流程如下:

(1)待测样品孔中每孔加入待测样品100μl,每种样品设3个平行孔;设两个阴性对照孔,每孔加未处理组的细胞裂解液100μl;另设一个空白对照孔,加入纯细胞裂解液100μl。

(2)酶标板置4℃,包被过夜。

(3)洗板:吸干孔内反应液,用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去),之后将洗涤液注满板孔,浸泡1-2分钟,间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

(4)阴性对照孔每孔加入PBS 50μl,样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的抗体工作液50μl。

(5)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。

(6)洗板,同(4)。

(7)每孔加1:5000稀释的抗体工作液100μl。

(8)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。

(9)洗板,同(4)。

(10)每孔加TMB显色液100μl,轻轻混匀10s,置37℃暗处反应15-20min。

(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。

(12)分别测450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,测得的OD值为两者之差(W1-W2),以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

(13)数据处理:在得出标本(S)和阴性对照(N)的OD值后,计算S/N值。

应用^[4][5]

人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒可以用于基于耳蜗核钙结合蛋白含量的变化探讨复聪片延缓老年C57BL/6J小鼠听力下降的实验研究

通过观察耳蜗核(CN)钙结合蛋白含量的变化探讨复聪片延缓老年C57BL/6J小鼠听力下降的可能机制,为复聪片防治老年性耳聋提供理论依据。

方法:6月龄C57BL/6J小鼠24只经ABR检测后随机分为2组,复聪片治疗组与老年空白组,分别喂养含复聪片的饲料、普通饲料6月。喂养结束取材时选取1月龄C57BL/6J小鼠12只作为青年空白组。各组动物通过听性脑干反应测听(ABR)评价听力情况;通过尼氏染色、免疫组化(IHC)及人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒观察三组小鼠CN神经元中尼氏体、钙结合蛋白(PV、CR、CB)的表达情况。

人钙结合蛋白(CR)Elisa试剂盒结果:1、青年空白组(1月龄)小鼠的平均听阈明显低于老年空白组(6月龄)及(12月龄),1月龄与6月、12月龄两者的听阈差异均具有显著性差异(P<0.01)。12月龄老年空白组与复聪片治疗组小鼠均出现不同程度的听阈升高,老年空白组升高更明显,两组听阈比较具有统计学意义(P<0.05)。2、青年空白组与老年空白组比较:老年空白组CN神经元中尼氏体、CB、CR含量较青年空白组均明显下降,PV含量较青年空白组升高,差异均具有统计学意义(P<0.05),且尼氏体、CB具有显著性差异(P<0.01)。3、复聪片治疗组与老年空白组比较:复聪片治疗组CN神经元中尼氏体、CB、CR含量高于老年空白组,PV低于老年空白组,两组中仅尼氏体、CB含量差异有统计学意义(P<0.05),CR、PV差异无统计学意义(P>0.05)。结论:老年C57BL/6J小鼠听力下降伴随着耳蜗核神经元的损伤及CB、CR的下降、PV的升高。复聪片能有效延缓其听力下降,作用机制可能与复聪片抑制了钙结合蛋白D-28K(CB)的减少,延缓了耳蜗核神经元的衰退有关。

参考文献

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[3]Redox modification of ryanodine receptor contributes to impaired Ca 2+homeostasis and exacerbates muscle atrophy under high altitude[J].Akanksha Agrawal;;Richa Rathor;;Ravi Kumar;;Geetha Suryakumar;;Som Nath Singh;;Bhuvnesh Kumar.Free Radical Biology and Medicine.2020

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[5]向红.基于耳蜗核钙结合蛋白含量的变化探讨复聪片延缓老年C57BL/6J小鼠听力下降的实验研究[D].湖南中医药大学,2022.