大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒是一种通过酶联免疫技术（Elisa）原理特异性识别样本中大鼠抑瘤素M(OSM)的商品化试剂盒。大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒可以通过识别样本中大鼠抑瘤素M(OSM)的类别及含量为科研及临床诊断提供依据。

需要注意的是若用于临床诊断的Elisa试剂盒需取得上市所在国的医疗器械资质。同时大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒的诊断结论存在一定的局限性，受限于样本保存不当、实验操作不规范，方法学灵敏度等原因不能作为临床判断的唯一依据。

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒技术原理：方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒样品收集、处理及保存方法:

1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒操作流程如下:

(1)待测样品孔中每孔加入待测样品100μl,每种样品设3个平行孔;设两个阴性对照孔,每孔加未处理组的细胞裂解液100μl;另设一个空白对照孔,加入纯细胞裂解液100μl。

(2)酶标板置4℃,包被过夜。

(3)洗板:吸干孔内反应液,用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去),之后将洗涤液注满板孔,浸泡1-2分钟,间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

(4)阴性对照孔每孔加入PBS 50μl,样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的抗体工作液50μl。

(5)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。

(6)洗板,同(4)。

(7)每孔加1:5000稀释的抗体工作液100μl。

(8)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。

(9)洗板,同(4)。

(10)每孔加TMB显色液100μl,轻轻混匀10s,置37℃暗处反应15-20min。

(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。

(12)分别测450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,测得的OD值为两者之差(W1-W2),以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

(13)数据处理:在得出标本(S)和阴性对照(N)的OD值后,计算S/N值。

应用^[4][5]

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒可以用于抑瘤素M与哮喘大鼠气道重塑的关系研究

观察抑瘤素M在哮喘大鼠气道壁中的表达,探讨抑瘤素M的表达与哮喘气道重塑的关系,为哮喘的防治寻找可能的靶点。

方法：选用30只Wistar雄性健康大鼠,鼠龄8W,体重200-220g。将30只Wistar大鼠随机分为二组：对照组和哮喘组。第一天哮喘组用用抗原混悬液2m1(含卵白蛋白100mg,氢氧化铝200mg、灭活百日咳杆菌菌苗6×109个)腹腔注射致敏。第15天开始1%卵白蛋白溶液雾化激发,每天一次,每次20—30分钟,共8W,建立哮喘模型。对照组第一天用第1天用生理盐水2m1腹腔注射,第15天开始用生理盐水雾化吸入,余同哮喘组。末次激发结24小时后,取各只大鼠的支气管肺泡灌洗液行嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞,淋巴细胞的分类计数。采取肺组织标本,采用HE染色观察气道形态学改变；采用免疫组化染色和大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒检测并经计算机图像分析测定气道壁中Oncostatin M蛋白表达水平；同时采用RT-PCR法测定肺组织中Oncostatin M mRNA的表达。

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒结果：(1)哮喘组大鼠支气管肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞浸润数为(9.21±1.24)与正常对照组比较(0.71±O..01),明显增加,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。而哮喘组大鼠支气管肺泡灌洗液巨噬细胞、中性粒细胞,淋巴细胞浸润数分别为(64.81±2.52)(11.52±2.02)(13.24±2,36)],与正常对照组[(80.19±2.02)(9.14±2.57)(10.54±1.50)]比较,差异具无统计学意义(P均>0.05)。病理证实哮喘模型基本成功。(2)哮喘组大鼠总管壁厚度(WAt/Pbm),气管内壁厚度(WAi/Pbm)及平滑肌层厚度(WAm/Pbm)分别为[(132.06±6.13)(81.52±1.55)(43.71±5.67)],与正常对照组[(79.84±2.40)(61.12±3.81)(16.78±2.13)]比较,显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05。(3)哮喘组肺组织中抑瘤素mRNA表达为(0.95±0.04),高于正常对照组的(0.45±0.16),差异具有统计学意义(P<0.01)。(4)抑瘤素M大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒高表达及免疫组化染色阳性细胞表达强度,哮喘组(0.34±0.13)明显强于对正常对照组大鼠(0.15±0.05),差异具有统计学意义(P<0.01)。(5)气管壁抑瘤素M水平与哮喘组大鼠总管壁厚度,气管内壁厚度,平滑肌层厚度呈正相关(R值分别为0.768、0.532、0.745,P均<0.05),对照组无相关性(R值分别为-0.135、-0.308、-0.325,P均>0.05)。(6)哮喘组嗜酸性粒细胞数与抑瘤素M水平正相关,(R=0.970,P=0.000),而中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数与抑瘤素M水平无相关(R值分别为0.020、0.180、-0.256,P均>0.05)。

参考文献

[1]ONCOSTATIN M(OSM)IS INCREASED IN ASTHMA WITH INCOMPLETELY REVERSIBLE AIRFLOW OBSTRUCTION[J].Jodie L.Simpson;;Katherine J.Baines;;Michael J.Boyle;;Rodney J.Scott;;Peter G.Gibson.Experimental Lung Research,2009(9)

[2]HGF synthesis in human lung fibroblasts is regulated by oncostatin M.[J].Cohen Murielle;;Marchand-Adam Sylvain;;Lecon-Malas Véronique;;Marchal-Somme Joëlle;;Boutten Anne;;Durand Geneviève;;Crestani Bruno;;Dehoux Monique.American journal of physiology.Lung cellular and molecular physiology.2006

[3]Toll-like receptor 2,3,and 4 expression and function in human airway smooth muscle[J].Maria B.Sukkar;;Shaoping Xie;;Nadia M.Khorasani;;Onn Min Kon;;Rex Stanbridge;;Razao Issa;;Kian Fan Chung.The Journal of Allergy and Clinical Immunology,2006(3)

[4]Oncostatin M causes VEGF release from human airway smooth muscle:synergy with IL-1beta.[J].Faffe Débora S;;Flynt Lesley;;Mellema Matthew;;Whitehead Timothy R;;Bourgeois Kerri;;Panettieri Reynold A;;Silverman Eric S;;Shore Stephanie A.American journal of physiology.Lung cellular and molecular physiology.2005

[5]刘慧兰.抑瘤素M与哮喘大鼠气道重塑的关系研究[D].中南大学,2012.