人抗肝特异性脂蛋白抗体(LSP)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人抗肝特异性脂蛋白抗体(LSP)ELISA KIT采用竞争法检测样本中抗肝特异性脂蛋白抗体(LSP)的含量。

原理：向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育30min，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素-HRP，在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合，洗涤后结合的HRP催化TMB（四甲基联苯胺）成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。

人抗肝特异性脂蛋白抗体(LSP)ELISA KIT

操作程序

1)使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。

2)空白孔不加样，只加显色剂A，B和终止液用于调零。

3)标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl。

4)样品孔：加入样品50μl（推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍），然后加入生物素抗原工作液50μl。

5)轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。

6)将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。

7)次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

8)加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育30min。

9)第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

10)显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

11)终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色).

12)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后10分钟以内进行。

13)计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线。

应用^[4][5]

用于乙型肝炎患者外周血CD5～+B细胞的研究

利用磁式细胞分选器分离B淋巴细胞，应用免疫组化技术检测了50例乙型肝炎患者外周血CD5+B细胞，在总B细胞中所占百分率分别为：急性乙型肝炎（24.6±4.2）％；慢性乙型肝炎（38.8±8.0）％；慢性重症乙肝（44.4±8.4）％；乙肝后肝硬化（64.7±7.5）％。10例正常对照组为（23.0±3.1）％。

结果显示，急性乙肝组与正常对照组无显著性差别，其余各疾病组均显著高于对照组。将各疾病组CD5+B细胞百分率与肝功能指标进行相关性分析，发现慢性乙型肝炎和慢性重症乙型肝炎患者外周血CD5+B细胞百分率与谷丙转氨酶（ALT）和总胆红素（TB）呈正相关，乙肝后肝硬化患者外周血CD5+B细胞百分率与ALT、谷草转氨酶（AST）、γ-谷氨酸基转移酶（γ-GT）、TB和直接胆红素（DB）的升高呈正相关，提示CD5+B细胞百分率的增高与肝功能的损伤有密切的伴随关系。

故检测CD5+B细胞对乙肝的发病及慢性化发展判断有一定的参考价值。

为了探讨乙肝患者B细胞CD5在基因水平上的变化，在分离B细胞的基础上，建立了RT-PCR半定量方法检测急性乙肝、慢性乙肝、慢性重症乙肝、乙肝后肝硬化患者外周血CD5mRNA的表达水平，CD5mRNA与管家基因β-actin的比值分别为0.27±0.16；0.76±0.18；0.80±0.20和1.82±0.25。而正常人外周血CD5mRNA的表达水平为0.25±0.12。提示CD5mRNA水平随乙型肝炎病情第二军医大学学位论文的发展逐步上升。

采用间接ELISA法检测了乙肝患者抗心磷脂抗体（ACA）、抗核抗体（ANA）、类风湿因子（RF）、抗钙调素抗体（抗CaM）、抗亲环素A抗体(抗CyPA人抗肝细胞膜特异性脂蛋白抗体（抗LSP）等自身抗体，发现CDS8细胞百分率和CDS mRNA水平在慢性乙肝思者、慢性重症乙肝、肝炎后肝硬化患者中与ACA、抗CaM水平呈正相关，肝炎后肝硬化患者与抗CyPA水平呈正相关，但CDS8细胞百分率、CDS mRNA与抗LSP无相关性。上述研究结果表明CDS卫细胞可能与乙肝患者的某些自身抗体的出现相关。

参考文献

[1]IPC:Professional Type 1 Interferon-Producing Cells and Plasmacytoid Dendritic Cell Precursors[J].Yong-Jun Liu.Annual Review of Immunology.2005

[2]Decreased Frequency and Function of Circulating Plasmocytoid Dendritic Cells（pDC）in Hepatitis B Virus Infected Humans[J].XUE-ZHANG DUAN,MIN WANG,HAN-WEI LI,HUI ZHUANG,DONGPING XU,FU-SHENG WANG.Journal of Clinical Immunology.2004(6)

[3]Japanese herbal medicine Inchin-ko-to as a therapeutic drug for liver fibrosis[J].Mie Inao,Satoshi Mochida,Atsushi Matsui,Yuichiro Eguchi,Yusufu Yulutuz,Yanhong Wang,Kayoko Naiki,Tohru Kakinuma,Kenji Fujimori,Sumiko Nagoshi,Kenji Fujiwara.Journal of Hepatology.2004(4)

[4]Herb medicine Inchin-ko-to（TJ-135）regulates PDGF-BB-dependent signaling pathways of hepatic stellate cells in primary culture and attenuates development of liver fibrosis induced by thioacetamide administration in rats[J].Yukihiro Imanishi,Naoto Maeda,Kohji Otogawa,Shuichi Seki,Hiroko Matsui,Norifumi Kawada,Tetsuo Arakawa.Journal of Hepatology.2004(2)

[5]杨瑞宁.乙型肝炎患者外周血CD5～+B细胞的研究[D].第二军医大学,2001.