鸡极低密度脂蛋白(VLDL)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

鸡极低密度脂蛋白(VLDL)ELISA KIT可以用于血清、血浆、组织等样本中极低密度脂蛋白(VLDL)的含量检测。

试验原理：鸡极低密度脂蛋白(VLDL)ELISA KIT是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

鸡极低密度脂蛋白(VLDL)ELISA KIT

鸡极低密度脂蛋白(VLDL)ELISA KIT操作步骤

1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9）在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于三酰甘油、富含三酰甘油的极低密度脂蛋白的脂质肾毒性研究

通过体外实验研究VLDL对大鼠系膜细胞增殖、转化生长因子（TGF-β1）表达、纤维连接蛋白（FN）的蛋白合成的影响以及P42／44MAPK细胞信号转导途径在其中的作用，以此探讨高TG、VLDL血症肾脏毒性的分子生物学机制。

实验方法：分为两个部分进行。1．体内实验：（1）选择雄性SD大鼠作为实验对象，将所有大鼠左侧肾脏切除，随机分为四组。分别为对照组（Control group,Con）、Exp组（Experimental Group,Exp）、吉非罗齐组（Gemfibrozil group,Gem）和太白楤木皂甙组（araloside group,Ara）。

（2）在实验进行至8、16周时，采血检测大鼠血脂、肾功能、血糖，收集24小时尿，检测大鼠尿白蛋白排泄率（UAE）。

（3）肾脏病理检查，包括油红染色观察脂质沉积情况、常规染色、电镜观察肾脏病变以及电子致密物沉积情况，免疫组化观察肾脏内细胞增殖情况以及免疫荧光镜检观察免疫复合物沉积情况。半定量计数肾小球细胞数，以及肾小球内PAS染色阳性区域面积百分比。

（4）分别采用RT－PCR法和Western Blot法检测肾组织TGF－plmRNA转录以及蛋白质表达情况。

（5）同位素标记法检测肾皮质P42 MAPK活性。

（6）统计分析血脂与UAE、肾小球内平均细胞数、肾小球内PAS阳性物质面积百分比以及P42 MAPK活性的相关性。

2体外实验：以大鼠系膜细胞为研究对象，制备VLDL后与系膜细胞共孵育并作以下实验门)采用XTT法、流式细胞术观察其对细胞增殖的影响。（2）采用ELISA法检测VLDL对细胞分泌FyJ的影响。（3）采用Western Blot法以及RT－PCR法检测TGF－PI蛋白质表达和mRNA转录情况。p（4）采用同位素标记测定P42 MAPK活性。（5）P42 MAPK的抑制剂PD98059阻断后，再观察VLDL对细胞增殖、TGF－61表达以及P42 MAPK活性的影响。

实验结果：1．体内实验：（1）实验进行到8周时，Exp组大鼠血清TG、VLDL水平显著升高，血清Chol、LDL、HDL、血糖、肾功能水平与对照组相比没有显著差异。经过降脂药物作用后，血清TG、VLDL水平显著下降。16周时EXp大鼠UAE较对照组显著增加；药物干预的组别UAE显著降低。

病理结果显示，EXp组肾脏内脂质沉积增加，主要位于肾小管和肾小球，肾小管较为显著。弥漫性系膜基质增加、局灶节段性甚至球性肾小球硬化，肾小球内细胞增生；少量肾小管扩张，空泡变性。偶见间质纤维化。部分中、小动脉玻璃样变，血管壁出现血浆样物质浸润以及血管狭窄。还可观察到炎性细胞浸润。免疫组化结果表明EXp组、Gem组、Ara组肾小球内细胞显著增殖。

兔疫荧光镜检结果示Ig G、Ig M、Ig A、C3、C4均为阴性。电镜结果显示，EXp组肾小球系膜基质增多，局灶性上皮细胞足突融合，胞浆脱落，未见电子致密物沉积。

另外，药物干预组大鼠肾脏内脂质沉积、肾小球系膜基质扩张以及增殖明显减轻，但与对照组相比病变仍显著。病理切片半定量结果显示Exp组、Gem组和Ara组肾小球内细胞数显著高于对照组。但Exp组系膜PAS阳性区面积的百分较对照组显著增加，但Ara组PAS阳性区面积百分比显著下降。RNA转录增强，而经降脂药物干预的各组大鼠肾脏表达减弱。

Exp组肾脏皮质P42 MAPK活性显著升高hs Con组人但降脂治疗没有降低P42 MAPK的活性。

参考文献

[1]Lovastatin inhibits proliferation of rat mesangial cells.O’Donnel Mp,Kasiske BL,Kim Y,et al.The Journal of Clinical Investigation.1993

[2]Apolipoproteins and lipoprotein receptors in glomeruli in human kidney diseases.Takamura T,Yoshika K,Aya N,et al.Kidney International.1993

[3]A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.Minsuhull J,Sun H,Tonks NK,et al.Cell.1994

[4]Activation of stress-activated protein kinase by MEKK1 phosphorylation of its activactor SEK1.Yan M,Dai T,Deak JC,et al.Nature.1994

[5]俞国庆.三酰甘油、富含三酰甘油的极低密度脂蛋白的脂质肾毒性研究[D].第二军医大学,2002.