大鼠透明质酸结合蛋白(HABP)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

大鼠透明质酸结合蛋白(HABP)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中透明质酸结合蛋白(HABP)的含量。

检测原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

大鼠透明质酸结合蛋白(HABP)ELISA试剂盒

样品收集、处理及保存方法

1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

3.样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。

4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于电击死大鼠皮肤特殊染色与心脏HIF-2α、H-FABP表达变化研究

建立在大鼠电击死模型的基础上,利用HE染色、EVG染色、Alcian blue-核固红染色、扫描电镜以及X线能谱检测法观察大鼠电击部位皮肤的特异性改变；同时对心脏缺氧诱导因子2α（HIF-2α）、心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）蛋白含量进行检测,以期为电击死的法医学判定提供依据。方法：1大鼠皮肤HE染色、皮肤EVG染色、皮肤Alcian blue-核固红染色和心肌免疫组织化学染色实验分组：健康Sprague-Dawley（SD）大鼠72只,雌雄不限,体重220±10g,适应环境喂养1周,按完全随机分组方法随机分为电击死组、死后电击组、正常对照组,每组24只。电击死组大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后连接自制电击装置,金属夹连接大鼠左前肢与右后肢,接通电源（220V,50Hz）电击至死,各亚组（每组8只）分别于死后即刻、死后30min、死后1h取电击部位皮肤和心脏；死后电击组大鼠水合氯醛麻醉后颈椎脱臼法处死,各亚组（每组8只）分别于死后即刻、死后30min、死后1h连接电击装置通电2min,电击后立即取电击部位皮肤和心脏；对照组大鼠麻醉后颈椎脱臼法处死,连接自制电击装置2min,不通电,各亚组（每组8只）分别于死后即刻、死后30min、死后1h取电击部位皮肤和心脏。组织取出后,立即放入4%多聚甲醛固定液中。2皮肤扫描电镜与X射线能谱分析实验分组：健康Sprague-Dawley（SD）大鼠60只,雌雄不限,体重220±10g,适应环境喂养1周,按完全随机分组方法随机分为电击死组、死后电击组、正常对照组,每组20只。电击死组大鼠经水合氯醛注射麻醉后连接自制电击装置,金属夹连接大鼠左前肢与右后肢,接通电源（220V,50Hz）电击至死,按连接金属片的不同分为铜、铁、铝、铅四个亚组,每组5只,死后立即取电击部位皮肤；死后电击组大鼠水合氯醛麻醉后颈椎脱臼法处死,于死后连接电击装置通电2min,按连接金属片的不同分为铜、铁、铝、铅四个亚组,电击后立即取电击部位皮肤；对照组大鼠麻醉后颈椎脱臼法处死,连接自制电击装置2min,按连接金属片的不同分为铜、铁、铝、铅四个亚组,不通电,取电击部位皮肤。数据以“均数±标准差（Mean+SD）"表示,用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA）,用最小显著差法（least significant difference,LSD）作两两比较,以P<0.05为有显著统计学差异。

心脏免疫组化染色结果

1心脏HIF-2a免疫组化染色结果HIF-2a蛋白在心肌细胞内表达为细胞核着色。对照组大鼠心脏偶见少量阳性表达,且各亚组无明显差异；电击死即刻组心肌细胞阳性表达明显增强,电击死30min组阳性表达与即刻组比较无明显差异,电击死60min组阳性表达减弱,但仍高于正常60min组；死后即刻电击组心肌细胞阳性表达较正常对照组增加,低于电击死即刻组,死后30min电击组、死后60min电击组阳性表达与正常30min、60min对照组比较无明显差异。

2心脏H-FABP免疫组化染色结果H-FABP蛋白在心肌细胞的表达为细胞胞浆着色。正常对照组大鼠心肌细胞阳性表达,可见少量点状缺染；电击死组大鼠心肌细胞可见缺染,且缺染面积随时间延长逐渐增大,即缺染面积：电击死即刻组<电击死30min组<电击死60min组；死后即刻电击组大鼠心肌细胞可见缺染,缺染面积高于对照组,小于电击死即刻组,死后30min电击组、死后60min电击组组与死后即刻电击组比较无明显差异。

参考文献

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[2]Cardiac pathology in fatal electrocution[J].B.Suresh Kumar Shetty,Tanuj Kanchan,Jenash Acharya,Ramadas Naik.Burns.2014

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[4]Characteristics of electrically injured skin from human hand tissue samples using Fourier transform infrared microspectroscopy[J].Shi-Ying Li,Dong-Hua Zou,Yi-Wen Luo,Qi-Ran Sun,Kai-Fei Deng,Yi-Jiu Chen,Ping Huang.Science＆Justice.2013

[5]冯国伟.电击死大鼠皮肤特殊染色与心脏HIF-2α、H-FABP表达变化研究[D].河北医科大学,2015.