大肠杆菌显色培养基的应用

背景^[1-3]

大肠杆菌显色培养基用于大肠杆菌的分离鉴定和计数，组分(g/L):琼脂:15.0;蛋白胨、牛肉膏、酵母膏:8.3;色素:9.0;盐类:5.0;pH:6.0±0.2。

培养基含X-葡萄糖醛酸，用于检测大肠杆菌特有的β葡萄糖醛酸酶。

大肠杆菌——蓝绿色

其他菌（如沙门）-无色

胆盐混合物增加选择性——革兰氏阳性菌被抑制。

大肠杆菌显色培养基

操作:

1.称取瓶内干粉,用1000mL蒸馏水或纯水溶解,可以按照37.3 g/L的比例扩大、缩小。

2.将上述干粉缓慢倒入蒸馏水中,充分搅拌直至琼脂完全溶解。

3.加热至100℃,并且不断搅拌。使用微波炉加热时,在煮沸后立即移出微波炉并不断搅拌,而后移入微波炉再加热,直至完全溶解(大气泡代替泡沫产生,大约需要2分钟)。也可使用高压锅,121℃加热15分钟。

4.加热后的培养基水浴冷却至40-45℃,轻轻地摇动均匀,倾入已灭菌的带盖的培养皿中,使其凝固。该培养基在室温可保存一天或冰箱内贮存两周(避光,2-8℃)。

大肠杆菌显色培养基接种:

使用倾注程序:将培养基水浴冷却至48℃,准备直径为90mm的已灭菌的带盖培养皿,每个培养基接种1mL样品,然后倾注10±1mL上述已充分溶解的培养基,混合均匀使其凝固,倒置,37℃培养24小时。

如果使用表面接种程序:将培养基倾注于已灭菌的培养皿中(用前贮存于2-8℃,避光,接种前应先恢复至室温)。样品划线接种或者将接种样品的膜放置于培养基表面,在37℃培养24小时。

应用^[4][5]

用于食品中产志贺毒素大肠杆菌的分离和快速鉴定研究

采用免疫磁珠富集分离目标菌株,结合多重PCR变性高效液相色谱技术（DHPLC）和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）,建立高通量快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的研究方法。

在本方法中,采用产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的标准菌株为代表对象进行方法研究。主要从四个方面进行项目研究,首先对目标菌株进行分离研究:采用免疫磁珠富集分离目标菌株,并验证磁珠的特异性及灵敏度。实际样品检测中,结合药物及显色培养基快速准确分离目标菌株。其次多重PCR-DHPLC检测方法的研究:以rfbE（O157）、wzx（O111）为目的基因,确立多重PCR-DHPLC反应条件及体系,验证该方法的特异性及灵敏度,并与RT-PCR方法进行灵敏度比较,随机抽取270份食品样品进行检测。

然后进行MALDI-TOF MS检测方法的研究:分析前期处理方法、培养基种类及培养时间对质谱图造成的影响,采用的方法获取目标菌株的质谱图并添加数据库中。对目标菌株设置不同的培养条件后,验证该方法的准确性。最后解决基质对菌体活性干扰及降解难题,分析其均匀性及稳定性,并在全国范围内开展检测O111和O157的能力验证。

在本次目标菌株富集分离研究中,结果表明免疫磁珠具有良好的特异性和灵敏度,可以应用于致病微生物的分离,提高检测效率。在多重PCR-DHPLC实验中,表明多重PCR-DHPLC具有良好的特异性并与RT-PCR具有相同梯度的灵敏度,可以同时检测O111和O157,检测限达到25 CFU/mL。在129份牛肉样品中,检出1例O111和3例O157;74份鸡肉样品中,检出O111和O157各1例;67份蔬菜样品中,并未检测到目标菌。

MALDI-TOF MS检测方法中,使用TSB液体培养基培养24-36 h获取目标菌株质谱图,添加数据库后,均鉴定为大肠杆菌。但是由于两种目标菌株质谱图相似,本次实验并没有完全准确鉴定两种目标菌株,需要结合分子及血清学达到精确鉴定的目的。能力验证样品研究中,绿豆粉作为基质,具有良好的均匀性及稳定性。在全国138间实验室组织开展能力验证,检测正确率为98%。

参考文献

[1]Rapid O serogroup identification of the six clinically relevant Shiga toxin-producing Escherichia coli by antibody microarray[J].Narasimha V.Hegde,Craig Praul,Andrew Gehring,Pina Fratamico,Chitrita DebRoy.Journal of Microbiological Methods.2013(3)

[2]Applicability of a multiplex PCR to detect O26,O45,O103,O111,O121,O145,and O157 serogroups of Escherichia coli in cattle feces 1[J].Zachary Paddock,Xiaorong Shi,Jianfa Bai,T.G.Nagaraja.Veterinary Microbiology.2011(3-4)

[3]A rapid procedure for the detection and isolation of enterohaemorrhagic Escherichia coli（EHEC）serogroup O26,O103,O111,O118,O121,O145 and O157 strains and the aggregative EHEC O104:H4 strain from ready-to-eat vegetables[J].Markus Tzschoppe,Annett Martin,Lothar Beutin.International Journal of Food Microbiology.2011(1)

[4]Growth of pure cultures of Verocytotoxin‐producing Escherichia coli in a range of enrichment media[J].C.L.Baylis.Journal of Applied Microbiology.2008(5)

[5]晚观生.食品中产志贺毒素大肠杆菌的分离和快速鉴定[D].大连工业大学,2016.