小鼠Β葡糖苷酶(Β-GLUCOSIDASE)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠Β葡糖苷酶(Β-GLUCOSIDASE)ELISA KIT用于测定血清、血浆、组织及相关液体样本中β葡糖苷酶的含量或活性。

小鼠Β葡糖苷酶(Β-GLUCOSIDASE)ELISA KIT检测原理:是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被Β葡糖苷酶捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Β葡糖苷酶呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

小鼠Β葡糖苷酶(Β-GLUCOSIDASE)ELISA KIT

样品收集、处理及保存方法：

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：edta、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于海洋黑曲霉生产耐盐型纤维素酶和β-葡糖苷酶及其酶学性质研究

首先,从海洋中筛选得到产耐盐纤维素酶的真菌,根据该真菌的形态,ITS序列和5%NaCl（w/v）最适生长盐度,鉴定该真菌为嗜盐海洋黑曲霉。海洋黑曲霉产生的纤维素酶最适温度和pH为58℃和4.5,在12%NaCl（w/v）溶液中的酶活,是在无NaCl溶液中酶活的1.33倍。该纤维素酶在黑液废水中降解纤维素,降解12h产生的葡萄糖比在自来水中降解纤维素产生的葡萄糖多了11.5%。

研究结果表明,海洋黑曲霉产生的纤维素酶是一种具有良好耐盐耐热性能的纤维素酶。其次,研究了纤维素酶的固体发酵工艺,实现了纤维素酶的环境友好型生产。固体发酵的天然培养基组成为：76.9%水葫芦（w/w）,8.9%玉米芯（w/w）,3.5%稻草粉（w/w）,10.7%麸皮（w/w）和干固体基质2.33倍的天然海水。天然海水中的主要无机盐都能增加纤维素酶的产量。发酵144h,纤维素酶的酶活达到17.80U/g干固体基质。

研究了液体发酵时海洋黑曲霉纤维素酶酶活和胞外蛋白表达对不同碳源的响应。海洋黑曲霉纤维素酶的酶活和胞外蛋白对不同碳源的响应有较大差异。在以玉米芯或稻草秆作为碳源时,液体发酵产生的内切酶、β-葡糖苷酶和纤维素酶的酶活分别为2.00U/mL和1.70U/mL、3.25U/mL和2.62U/mL、0.13和0.08U/mL,比活力分别为1.39U/mg蛋白和1.31U/mg蛋白,3.25U/mg蛋白和2.62U/mg蛋白,0.181U/mg蛋白和0.165U/mg蛋白。二维电泳分析表明,以玉米芯或稻草秆作为碳源时,海洋黑曲霉产生的胞外蛋白的种类差异达到15种。

用丝瓜囊作为固定化载体固定海洋黑曲霉,连续批次发酵生产p-葡糖苷酶。丝瓜囊固定的菌丝量达到3.1g/L,固定效率达到95%以上。固定化发酵缩短了发酵周期,达到产量的时间由游离发酵的7d降为固定化发酵的4.5d。固定化发酵的第3、4批次的产量高于游离发酵的产量,固定化连续5批次发酵的p-葡糖苷酶产量均高于110U/mL。

研究了p-葡糖苷酶在不同盐度下的酶学性质和热失活动力学。粗p-葡糖苷酶在6%NaCl（w/v）溶液中的酶活最高。在0%和6%NaCl（w/v）溶液中的最适温度和pH相同,都为66‰和5.0。在6%NaCl（w/v）溶液中的酶活是在无NaCl溶液中的1.46倍。在62℃,65℃,67℃和70℃,p-葡糖苷酶在6%NaCl（w/v）溶液中的半衰期均高于在无NaCl溶液中半衰期的2倍以上。p-葡糖苷酶在6%NaCl（w/v）溶液中的热失活自由能比在无NaCl溶液中的热失活自由能和熔点温度分别高了约2kJ/mol,熔点温度也略微提高。纯化后测得p-葡糖苷酶的分子量约为110kDao在高盐度环境下,纯p-葡糖苷酶的酶活和半衰期的增长与粗p-葡糖苷酶酶活和半衰期的增长相似。研究结果表明该海洋黑曲霉产生的p-葡糖苷酶是耐盐耐热型p-葡糖苷酶。

构建了p-葡糖苷酶的分子模型,探讨了该类酶的耐盐机制。建立了该类酶的分子模型,大量的谷氨酸和天冬氨酸残基分布在分子模型表面。在分子表面的大量酸性氨基酸残基赋予p-葡糖苷酶高负离子型表面,高负离子型表面和分子内核的作用可能增强了p-葡糖苷酶在高盐环境下的热稳定性。p-葡糖苷酶在高盐度下活性增加的原因可能是高盐的环境使p-葡糖苷酶异构化,异构体的催化位点更容易与底物纤维素二糖作用。

参考文献

[1]Antimicrobial potential of Actinomycetes species isolated from marine environment[J].S Valli,Sugasini S Suvathi,OS Aysha,P Nirmala,Kumar P Vinoth,A Reena.Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine.2012(6)

[2]Ultrasound induced production of thrombinase by marine actinomycetes:Kinetic and optimization studies[J].Balakrishnan Naveena,Punniavan Sakthiselvan,Periyasamy Elaiyaraju,Nagarajan Partha.Biochemical Engineering Journal.2011

[3]Screening for toxigenic marine-derived fungi in Algerian mussels and their immediate environment[J].Aquaculture.2012

[4]Cellulase production in a new mutant strain of Penicillium decumbens ML-017 by solid state fermentation with rice bran[J].Yun-Tao Liu,Ze-Yu Luo,Chuan-Nan Long,Hai-Dong Wang,Min-Nan Long,Zhong Hu.New BIOTECHNOLOGY.2011(6)

[5]薛栋升.海洋黑曲霉生产耐盐型纤维素酶和β-葡糖苷酶及其酶学性质研究[D].浙江大学,2012.