抗荧光增白剂KSN单克隆抗体的应用

背景^[1-3]

抗荧光增白剂KSN单克隆抗体是一类由B细胞分泌可以特异性结合荧光增白剂KSN的免疫蛋白，主要用于体外检测荧光增白剂KSN的免疫学实验。

荧光增白剂KSN与OB-1具有类似的化学结构，但对聚酯纤维及塑料制品的增白效果比OB-1更佳，而且与塑料的相溶性比OB-1更好，很少用量就能产生非常好的增白效果，这是OB-1远不及的。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体，即单克隆抗体。

抗荧光增白剂KSN单克隆抗体免疫组化

单克隆抗体制备

单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。

(1)体内诱生法取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

(2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

应用^[4][5]

用于酿酒酵母PMT1基因缺失延长细胞复制寿命的机制研究

研究内容与实验方法如下：1.依据基因同源重组的原理构建PMT家族单基因缺失（pmtl△～pmt6A）酵母菌株、PMT1与HAC1或IRE1双基因缺失（pmtl△hacl△和pmtl△irel△）酵母菌株模型。在Scope A I光学显微镜下,用玻璃纤维针对酵母母细胞和子细胞进行分离,并计数子细胞数量,统计分析酵母细胞复制寿命,研究PMT家族成员是否参与调控酵母细胞的复制寿命。采用RT-PCR检测pmtl△菌株中HACl mRNA的剪接情况,实时荧光定量PCR检测UPR通路中部分靶基因的转录水平,Western Blot检测内质网伴侣分子Kar2蛋白的表达水平,以探讨PMTl调控酵母细胞复制寿命与UPR信号通路的关系；

2. 依据基因同源重组的原理成功构建TED1基因缺失（tedl△）酵母菌株,PMTl与TED1双基因缺失（pmtl△tedl△）酵母菌株（Pmtlp和Tedlp形成复合物）,以及PMT1与TED1和HAC1三基因缺失Cpmtl△tedl△hacl△)酵母菌株模型。采用酵母细胞复制寿命检测方法和实时荧光定量PCR方法,分析酵母菌株的寿命变化和UPR通路活性变化,研究PMT1与TED1在寿命调控方面是否存在关联,探讨UPR信号通路调控寿命的可能机制。

3. 分别用衣霉素和刚果红/荧光增白剂作为内质网应激和细胞壁应激的诱导剂,通过单克隆形成实验方法观察PMT1与TED1对细胞应激的敏感性。研究酵母细胞应激能力与UPR信号通路和细胞壁完整性通路的关系,进而探讨酵母细胞复制寿命与应激能力之间的调控关系。

结果及结论如下：1.在PMT家族基因缺失酵母菌株中,仅pmtl△菌株平均复制寿命延长约20%（p<0.0001）,缺失HAC1或IRE1基因能缩短pmtl△菌株的复制寿命。缺失PMT1基因能诱导HAC1 mRNA剪接,进而上调UPR通路中部分下游靶基因的表达水平,这些靶基因包括内质网伴侣分子（KAR2和LHS1）,参与蛋白质输出的基因（FKB2）和氧化折叠的基因（EUG1和ERO1）。同时,内质网伴侣分子Kar2蛋白表达水平也明显上调。这些结果提示PMT1基因缺失延长酵母细胞的复制寿命,寿命延长与UPR活性上调相关；

2. 与野生型酵母菌株比较,tedl△菌株平均复制寿命明显缩短约14%（p<0.001）,缺失PMT1基因能明显延长tedl△菌株的复制寿命,寿命延长依赖HAC1的存在。并且,缺失PMT1基因能诱导tedl△菌株HAC1 mRNA的剪接,上调UPR靶基因的表达水平。该结果提示缺失PMT1基因可能通过上调UPR活性来恢复tedl△菌株较短的复制寿命。

3.野生型酵母菌株中缺失PMT1基因对内质网应激敏感,但是在hacl△菌株中缺失PMT1基因可以增强细胞对内质网应激的抗性。缺失PMT1基因可以导致tedl△菌株对内质网应激和细胞壁应激的敏感性。这表明长寿命的酵母菌株不一定具有较强的应激能力。

参考文献

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[5]崔红晶.酿酒酵母PMT1基因缺失延长细胞复制寿命的机制研究[D].重庆医科大学,2015.