LLC小鼠肺癌细胞的应用

背景^[1-3]

LLC小鼠肺癌细胞是从小鼠肺癌组织中分离并培养成的稳定原代细胞系，商品化的小鼠肺癌细胞LLC主要来源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、LLC小鼠肺癌细胞promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC等细胞系。

原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，也称初代培养。严格地说即从体内取出组织接种培养到次传代阶段，但实际上，通常把代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。

LLC小鼠肺癌细胞

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

应用^[4][5]

用于抑制Rac1减轻小鼠放射性肺损伤并增敏肺癌放疗的作用与机制研究

针对Rac1在胸部放疗所致肺损伤中的作用进行研究,从动物和细胞两个水平观察抑制Rac1对放射性肺损伤的防护效果,另一方面验证其对肿瘤放疗的影响。并进一步通过转录组测序及分析,筛选并验证Rac1下游的作用分子,从而阐明Rac1与放射性肺损伤及肿瘤放疗关系的作用机制。

探索抑制Rac1对放射性肺损伤的防护作用及机制,验证抑制Rac1对正常肺组织与肿瘤细胞的差异效应,探索介导该差异效应的分子机制。

方法:使用60Co放射源,构建放射性肺损伤小鼠模型,使用Rac1特异性抑制剂NSC23766和H&E染色、Masson染色方法,研究抑制Rac1对模型小鼠照射后肺组织肺炎、肺纤维化程度的影响,并通过免疫组织化学染色法研究抑制Rac1对模型小鼠照射后肺组织DNA损伤标志物磷酸化H2AX（γ-H2AX）、放射损伤标志物TGF-β和EMT标志物vimentin的表达影响。

使用小鼠正常肺上皮细胞系MLE-12,使用Rac1特异性抑制剂NSC23766及构建Rac1敲除细胞系的方式,通过免疫蛋白印迹法（Western Blot,WB）研究放射后凋亡相关蛋白、细胞周期相关蛋白及DNA损伤相关蛋白表达变化,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率、PI/RNase染色法检测细胞周期分布、Ed U法检测细胞增殖活力,从细胞水平上验证抑制Rac1对放射性肺损伤的保护效应。通过转录组测序寻找抑制Rac1引起的差异基因表达,筛选抑制Rac1介导其效应的可能通路,实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）法验证转录组测序结果,从细胞水平上研究介导Rac1差异作用的分子机制。

进一步利用小鼠肺癌细胞系LLC研究抑制/敲除Rac1对肿瘤细胞的辐射增敏效应。最后,构建裸鼠皮下荷瘤模型、小鼠肺部原位荷瘤模型,结合使用Rac1抑制剂NSC23766,进一步在体验证抑制Rac1对正常肺组织与肿瘤细胞的双向作用。

研究结果:（1）Rac1抑制剂NSC23766可减轻小鼠放射性肺炎及肺纤维化;（2）抑制或敲除Rac1对MLE-12细胞的增殖活力无明显影响,可减少MLE-12细胞照射后凋亡、逆转MLE-12细胞照射后G2/M期阻滞、减轻MLE-12细胞照射后DNA损伤;（3）敲除Rac1可下调肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1（Tumor protein p53-inducible nuclear protein 1,Trp53inp1）,过表达Trp53inp1可部分逆转敲除Rac1对MLE-12的辐射防护效应;（4）抑制或敲除Rac1可显著抑制LLC细胞增殖活力、增加LLC细胞照射后凋亡,对LLC细胞照射后周期阻滞无明显影响;（5）过表达Trp53inp1可协同敲除Rac1的促LLC凋亡效应,对小鼠肺癌细胞周期及增殖活力无明显影响;（6）肿瘤细胞LLC的Rac1表达显著高于正常肺上皮细胞MLE-12,且存在Rac1插入突变;（7）肿瘤细胞LLC的Trp53inp1表达显著低于正常肺上皮细胞MLE-12;

参考文献

[1]Compartmentalisation of RAC1 signalling[J].Aishwarya Payapilly,Angeliki Malliri.Current Opinion in Cell Biology.2018

[2]Relevance of small GTPase Rac1 pathway in drug and radio-resistance mechanisms:Opportunities in cancer therapeutics[J].G.A.Cardama,D.F.Alonso,N.Gonzalez,J.Maggio,D.E.Gomez,C.Rolfo,P.L Menna.Critical Reviews in Oncology/Hematology.2018

[3]Oncogenic RAC1 and NRAS drive resistance to endoplasmic reticulum stress through MEK/ERK signalling[J].Michael D.Bright,Paul A.Clarke,Paul Workman,Faith E.Davies.Cellular Signalling.2018

[4]The role of small GTPases of the Rho/Rac family in TGF‐β‐induced EMT and cell motility in cancer[J].Hendrik Ungefroren,David Witte,Hendrik Lehnert.Developmental Dynamics.2018(3)

[5]安妮.抑制Rac1减轻小鼠放射性肺损伤并增敏肺癌放疗的作用与机制[D].中国人民解放军海军军医大学,2020.