内源性亲和素-生物素封闭试剂盒的应用

背景^[1-3]

内源性亲和素-生物素封闭试剂盒为预处理提供了一种方法和试剂，当使用生物素-亲和素或生物素-链霉素亲和素检测系统识别细胞靶标时，可以减少或消除背景信号。

内源性生物素广泛分布于哺乳动物组织，尤其在肝脏、肺、脾、脂肪、脑等组织中。组织经过福尔马林固定后，内源性产生的背景会降低，但冷冻切片中的背景会大大增强。剧烈的抗原修复会将经过福尔马林固定组织中的内源性物质暴露出来，譬如内源性亲和素-生物素。本试剂盒含有内源性亲和素封闭液和生物素封闭液，能够很好的抑制内源性物质(主要是内源性亲和素-生物素)的活性，尤其适用于免疫组化中封闭内源性物质的活性。

内源性亲和素-生物素封闭试剂盒

操作步骤：

1、切片脱蜡、水化。

2、入内源性亲和素封闭液，孵育20min。

3、PBS或Tris缓冲液中清洗5min。

4、入内源性生物素封闭液，孵育20min。

5、PBS或Tris缓冲液中清洗5min。

6、进行免疫染色的步骤。

应用^[4][5]

用于基于亲和素—生物素双夹心体系测定外源性蛋白血清动态浓度的非抗体依赖新方法及肿瘤微环境影响肥大细胞在肿瘤组织分布的初步研究

亲和素-生物素系统在分子识别、相互作用、纯化、检测、固定、标记、病毒载体及非放射性药物靶向系统等研究中发挥着重要作用。但在多数情况下是将生物素标记抗体或抗原,与相应的抗原或抗体反应后,以酶或荧光素标记亲和素作为检测信号。

研究基于双抗体夹心ELISA的原理,利用亲和素-生物素的结合特点,建立了一种检测外源性蛋白质/多肽的血清动态浓度的新型方法,即包被亲和素-生物素标记蛋白-检测亲和素的双夹心体系,简称SA双夹心体系。

该方法特异性强、灵敏度高,不依赖抗体或放射性同位素,且使用简便和成本廉价,并成功应用于两种生物素标记外源蛋白的小鼠血清动态浓度检测中,可望在外源蛋白多肽类大分子及其药物的体内定量检测和代谢动力学研究中广泛应用。

一、亲和素-生物素标记蛋白/多肽双夹心体系的建立以链亲和素为捕获分子,加入待测生物素标记蛋白或多肽,辣根过氧化物酶标记链亲和素为检测分子,构建链亲和素-生物素标记大分子-酶链亲和素的双夹心体系（SA双夹心体系）,并进行特异性、灵敏度、准确性及稳定性评价。

结果显示,SA双夹心体系的检测特异性强,与非生物素化蛋白不存在非特异结合；灵敏度高,检测下限可达0.3125ng/ml,且可通过改变亲和素的固相包被浓度调整检测的敏感度与检测范围；准确性高,回收率为97.82%～107.92%；稳定性好,批内与批间检测的变异系数分别<5.76%和<8.42%。

二、亲和素-生物素双夹心体系的体内应用从体外的平行性试验和小鼠的体内试验两方面,对SA双夹心体系是否适用于外源蛋白的体内浓度监测进行可行性评价。结果显示,血清内源性成分对双夹心体系的干扰可通过提高SA的固相包被浓度而消除,但对肝组织匀浆内源性成分的干扰不能减弱,提示目前该体系只适用于血清样品的检测。SA双夹心体系成功应用在生物素标记人血清白蛋白和生物素标记鸡卵黏蛋白的小鼠血清动态浓度检测中,进一步验证了该方法在检测血清样品时的可行性。

与实验室已建立的双抗体夹心ELISA进行比较,SA双夹心体系的检测灵敏度更佳,并且两者在检测同一血清样品时的定量结果相符。该结果提示我们建立的SA双夹心体系具有良好的灵敏度与准确性。恶性肿瘤是严重危害人类健康的重要疾病。近年发现肿瘤微环境的血管内皮细胞、免疫细胞及其他各种间质细胞在肿瘤发展和转移过程中同样具有举足轻重的作用。

在大多数实体瘤中,髓源细胞是肿瘤间质的重要成分,占间质细胞50%以上,包括单核/巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞、肥大细胞及MDSCs等。肥大细胞作为一种多功能的、组织归巢型细胞,其在变态反应与抗寄生虫感染的作用已受到了人们的广泛关注。

但随着在大多数实体瘤中发现大量肥大细胞的浸润,探索肥大细胞是否影响及如何影响肿瘤的发生发展逐渐得到学者们的关注。肥大细胞本身能够合成和释放多种生物活性因子,具有广泛的生物学作用,如促血管生成作用、免疫正向/负向调节等。肥大细胞的类型及所在微环境将影响其激活模式及释放产物的种类,最终导致不同的生物学作用。

大多数研究表明肿瘤中的肥大细胞主要聚集在肿瘤周边与正常组织交界的部位,且多在血管周围,而肿瘤中心部位的肥大细胞较少甚至缺乏。因此,目前的实验研究主要关注肿瘤边界的肥大细胞,而关于癌巢中肥大细胞的数据较少。然而,有研究认为肿瘤中肥大细胞的分布部位与其功能有关：肿瘤边界的肥大细胞发挥促瘤作用,癌巢内的肥大细胞发挥抑瘤作用。

参考文献

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[2]Myeloid-Derived Suppressor Cells as a Vehicle for Tumor-Specific Oncolytic Viral Therapy[J].Samuel Eisenstein,Brian A.Coakley,Karen Briley-Saebo,Ge Ma,Hui-ming Chen,Marcia Meseck,Stephen Ward,Celia Divino,Savio Woo,Shu-Hsia Chen,Ping-Ying Pan.Cancer Research.2013(16)

[3]Rosiglitazone and Gemcitabine in combination reduces immune suppression and modulates T cell populations in pancreatic cancer[J].Stephanie K.Bunt,Ashley M.Mohr,Jennifer M.Bailey,Paul M.Grandgenett,Michael A.Hollingsworth.Cancer Immunology,Immunotherapy.2013(2)

[4]The immunosuppressive tumour network:myeloid‐derived suppressor cells,regulatory T cells and natural killer T cells[J].Dennis Lindau,Paul Gielen,Michiel Kroesen,Pieter Wesseling,Gosse J.Adema.Immunology.2013(2)

[5]余颖欣.基于亲和素—生物素双夹心体系测定外源性蛋白血清动态浓度的非抗体依赖新方法及肿瘤微环境影响肥大细胞在肿瘤组织分布的初步研究[D].南方医科大学,2014.