小鼠肾小管上皮细胞说明书的应用

背景^[1-3]

小鼠肾小管上皮细胞采用先机械研磨过不锈钢网筛分离得到肾小管、后用胶原酶消化，结合上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来；细胞经Cytokeratin-18/PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

小鼠肾小管上皮细胞分离自肾组织；肾脏是机体的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除体内代谢产物及某些废物、毒物，同时经重吸收功能保留水份及其他有用物质，如葡萄糖、蛋白质、氨基酸、钠离子、钾离子、碳酸氢钠等，以调节水、电解质平衡及维护酸碱平衡。

小鼠肾小管上皮细胞

肾脏同时还有内分泌功能，生成肾素、促红细胞生成素、活性维生素D3、前列腺素、激肽等，又为机体部分内分泌激素的降解场所和肾外激素的靶器官。肾脏的这些功能，保证了机体内环境的稳定，使新陈代谢得以正常进行。肾小管是机体肾脏器官上与肾小囊壁层相连的一条细长上皮性小管，具有重吸收（reabsorption）和排泌作用。

肾小管上皮细胞主要功能：①肾小管上皮细胞重吸收原尿中几乎全部的葡萄糖和氨基酸；②排泌非营养物质进入终尿；③细胞能分泌炎症介质如细胞因子和趋化因子，通过产生IL-8或直接趋化白细胞参与急性炎症反应；④移植肾炎症和新月体肾炎中PTEpiC表达IL-2R和MHC-Ⅱ类抗原，这说明肾小管上皮细胞参与肾免疫损伤的发生。

随着对肾间质纤维化机制研究的日渐加深肾小管上皮细胞（RTECs）在其中的作用日益被人们重视。因此，提供良好的肾小管上皮细胞模型，在肾小管间质疾病的发病机制和治疗药物筛选的研究中是非常重要的。

应用^[4][5]

用于STZ诱导的糖尿病肾病小鼠肾小管上皮细胞线粒体自噬及其相关蛋白的表达研究

建立Ⅰ型糖尿病肾病小鼠模型,主要研究：1、观察Ⅰ型糖尿病肾病小鼠模型肾小管上皮细胞线粒体自噬情况；2、观察线粒体自噬调节蛋白Nix在Ⅰ型糖尿病肾病小鼠模型中肾小管上皮细胞的表达及分布情况。

方法：（1）动物分组及建模：将17只雄性ICR小鼠随机分为正常对照组（Control组,n=5）、糖尿病肾病模型组（STZ组,n=6）和糖尿病肾病药物3-MA干预组（STZ+3-MA组,n=6）,成模后予以药物干预并在第八周末宰杀小鼠取出肾脏实验；

（2） RT-PCR方法检测Nix的mRNA表达情况；

（3） 免疫组织化学、Western blot方法检测LC3-Ⅱ、P62和Nix的蛋白表达情况；

（4） 免疫荧光共定位检测线粒体标记物VDAC与自噬体标记物LC3共定位情况；

（5）电镜观察肾小管上皮细胞线粒体自噬现象。

结果：（1）成功构建Ⅰ型DKD小鼠模型：72小时后尾静脉采血,当空腹血糖维持在13.9mmol/L或随机血糖维持在16.7mmol/L以上,则认为糖尿病模型成模。且在8周末时,糖尿病肾病小鼠的血糖显著高于正常对照组；光镜及电镜可见肾小球肥大,部分肾小球系膜细胞增生、系膜基质增多,肾小管扩张。

（2）STZ小鼠肾组织LC3-Ⅱ、P62、Nix蛋白表达：Westem blot显示STZ组小鼠较正常对照组小鼠肾脏p62、LC3-Ⅱ、Nix表达上调（P<0.05）；而自噬抑制剂3-MA干预的STZ小鼠则较STZ小鼠肾脏组织p62、LC3-Ⅱ表达下调（P<0.05）,Nix表达下降,但无统计学差异；免疫组化结果与Westem blot结果一致,且该四种蛋白主要在肾小管上皮细胞表达。

（3）免疫荧光示STZ小鼠肾脏组织（主要是肾小管上皮细胞）线粒体外膜蛋白VDAC与自噬体标记物LC3-Ⅱ共定位增加,而自噬抑制剂3-MA干预的STZ小鼠则较糖尿病肾病小鼠肾脏组织VDAC与LC3-Ⅱ共定位减少。

（4）电镜技术观察到STZ组小鼠肾小管上皮细胞线粒体自噬现象,而正常对照组及3-MA+STZ组并未观察到线粒体自噬现象。

参考文献

[1]LC3-associated phagocytosis[J].Susana Romao,Christian Münz.Autophagy.2014(3)

[2]Temporal Profile of Diabetic Nephropathy Pathologic Changes[J].Cecilia Ponchiardi,Michael Mauer,Behzad Najafian.Current Diabetes Reports.2013(4)

[3]Mitochondrial dysfunction and the inflammatory response[J].María J.López-Armada,Romina R.Riveiro-Naveira,Carlos Vaamonde-García,Marta N.Valcárcel-Ares.Mitochondrion.2013(2)

[4]Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner[J].Magdalena Frank,Stéphane Duvezin-Caubet,Sebastian Koob,Angelo Occhipinti,Ravi Jagasia,Anton Petcherski,Mika O.Ruonala,Muriel Priault,Bénédicte Salin,Andreas S.Reichert.BBA-Molecular Cell Research.2012(12)

[5]徐燕.STZ诱导的糖尿病肾病小鼠肾小管上皮细胞线粒体自噬及其相关蛋白的表达[D].中南大学,2014.