人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF AB)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF AB)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF AB)的含量。

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF AB)ELISA KIT应用双抗体夹心法测定标本中人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF AB)水平。用纯化的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF AB)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF AB),再与HRP标记的GM-CSF AB抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF AB)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抗体(GM-CSF AB)浓度。

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子基因克隆、表达、摇瓶培养及分离纯化的研究

利用梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear,PBMCs）,利用免疫磁珠分选方法纯化CD14+单核细胞。培养纯化后的CD14+单核细胞,加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）诱导5天,换液后加入干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）继续诱导24小时,使单核细胞向M1型巨噬细胞极化。

加入巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor,M-CSF）诱导5天,换液后加入白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）和IL-13继续诱导24小时,使单核细胞向M2型巨噬细胞极化。利用流式细胞术、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）和实时定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain,RT-q PCR）,分别在表型、细胞因子和基因水平验证巨噬细胞的诱导是否成功。

从健康者和直接抗病毒药（direct-acting antivirals,DAAs）治疗前后的慢性丙型肝炎病毒（Chronic Hepatitis C virus,CHC）感染患者的外周血中分离出单个核细胞。

利用免疫磁珠纯化CD14+单核细胞,利用上述相应的刺激剂和刺激条件诱导单核细胞极化为M1和M2两种亚型的巨噬细胞。在表型、细胞因子分泌和基因表达层面分析HCV对巨噬细胞极化的影响。

在体外实验中,纯化健康者外周血CD14+单核细胞,在M1和M2型巨噬细胞诱导培养体系中加入HCV core蛋白或β-半乳糖苷酶,利用流式细胞术、ELISA和RT-q PCR,分别在表型、细胞因子和基因水平测定HCV core蛋白对巨噬细胞极化的影响。

另外,行吞噬实验和T细胞增殖实验,利用流式细胞术检测加或不加HCV core蛋白诱导而成的巨噬细胞的吞噬功能、抗原提呈功能及对CD4+T细胞的免疫调节功能。利用western blot测定HCV core蛋白对巨噬细胞信号传导与转录激活子（Signal Transducer And Activator Of Transcription,STAT）表达的影响。

为了研究HCV core蛋白抑制单核细胞向巨噬细胞分化的分子机制,toll样受体（toll-like receptor,TLR）2的配体（Pam3CSK4）、TLR2的抗体和STATs的抑制剂加入巨噬细胞诱导体系中进行研究。如上,利用流式细胞术、ELISA和RT-q PCR检测信号分子TLR2和STATs对巨噬细胞极化的影响。

参考文献

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[5]张茜茜.丙肝病毒核心蛋白抑制单核细胞向巨噬细胞极化的作用研究[D].吉林大学,2016.