人血栓调节蛋白(TM)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人血栓调节蛋白(TM)ELISA KIT用于测定人血清，血浆及相关液体样本中凝血因子人血栓调节蛋白(TM)含量。

实验原理：本试剂盒应用间接法测定标本中人凝血因子人血栓调节蛋白(TM)水平。用纯化的人凝血因子人血栓调节蛋白(TM)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入已知浓度的凝血因子人血栓调节蛋白(TM)标准品和未知浓度的凝血因子人血栓调节蛋白(TM)待检样品，温育后，加入生物素标记的抗IgG抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的凝血因子人血栓调节蛋白(TM)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人凝血因子人血栓调节蛋白(TM)浓度。

人血栓调节蛋白(TM)ELISA KIT

操作步骤：

1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

2、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此

重复5次，拍干。

5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

10分钟.

7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于抗人血栓调节蛋白单克隆抗体的制备及初步应用研究

建立稳定表达人血栓调节蛋白（hTM）的克隆细胞株,制备抗hTM单克隆抗体（McAb）,为心血管疾病的研究提供基础。

方法:（1）重组表达质粒pThr402提纯后经lipofectamine脂质体转染CHO,经G418筛选,流式细胞术及Western blotting检测,获得稳定高表达hTM的克隆细胞株CHO-TM。

（2） 采用CHO-TM细胞作为免疫原,免疫Balb/c雌性小鼠,按常规方法融合并经CELISA法筛选,制备稳定分泌抗人血栓调节蛋白MaAb的克隆细胞株,并对McAb的亚类、免疫活性、细胞与组织特异性及识别抗原特异性进行鉴定。

（3） 收集动脉粥样硬化病人血标本,将抗人血栓调节蛋白McAb应用于Western blotting检测病人的sTM水平。

结果:（1）成功获得了稳定、高效表达hTM的克隆细胞株CHO-TM1、CHO-TM3～6。其中CHO-TM6的表达量最高,阳性细胞百分率与平均荧光强度分别为89.00%和9.84。

（2） 成功制备了抗人血栓调节蛋白McAb,命名为NH-1。琼脂糖免疫双扩散法鉴定NH-1的重链为IgGl亚类。CELISA法测定其腹水效价为5×10-5,M750-B紫外分光光度仪测定腹水抗体含量为20mg/ml。流式细胞仪检测该抗体与CHO-TM6和HUVEC呈阳性反应,与CHO及正常人外周红细胞、白细胞、未活化血小板呈阴性反应。

ABC免疫组织化学法检测正常人组织切片显示其该抗体除与子宫和前列腺有交叉反应外,与小肠、胸腺、脾、甲状腺、胆囊、卵巢、膀胱、肝脏、肾脏、胃等组织呈阴性反应,各组织中的血管内皮细胞均有hTM表达。Western blotting分析显示McAb NH-1可特异地识别还原条件下相对分子量为105KD左右的蛋白多肽。

参考文献

[1]Circulating Endothelial Cells:A New Candidate Biomarker of Irreversible Pulmonary Hypertension Secondary to Congenital Heart Disease[J].Circulation.2009(3)

[2]The relationship of circulating endothelial cells to plasma indices of endothelial damage/dysfunction and apoptosis in acute coronary syndromes:implications for prognosis[J].C.J.BOOS,B.BALAKRISHNAN,A.D.BLANN,G.Y.H.LIP.Journal of Thrombosis and Haemostasis.2008(11)

[3]Circulating Endothelial Cells as a Prognostic Marker in Thrombotic Microangiopathy[J].Uta Erdbruegger,Alexander Woywodt,Torsten Kirsch,Hermann Haller,Marion Haubitz.American Journal of Kidney Diseases.2006(4)

[4]Pathogenic Mechanisms Of Anti‐Endothelial Cell Antibodies（AECA）:Their Prevalence And Clinical Relevance[J].Cristiano Alessandri,Michele Bombardieri,Guido Valesini.Advances in Clinical Chemistry.2006

[5]郭紫芬.抗人血栓调节蛋白单克隆抗体的制备及初步应用研究[D].南华大学,2005.