增强型 ECL化学发光底物试剂盒的应用

背景^[1-3]

增强型ECL化学发光底物试剂盒是化学发光系统，用于检测固定在膜上的蛋白或核酸，灵敏度高，背景低，检测灵敏度可达纳克(nanogram)级，适用于检测极微量的蛋白或核酸。发光信号较稳定，便于反复曝光操作。采用对碘苯酚作为发光增强剂，与普通ECL化学发光底物相比，可明显减少一抗和二抗的使用量。

增强型ECL化学发光底物试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶（HRP）的抗体、抗原或者核酸。蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以HRP标记的抗体或探针结合膜上的目的蛋白或核酸，洗膜后置于用本产品配制的ECL工作液中，室温孵育数分钟，HRP使工作液中的鲁米诺（Luminol）氧化并发光，试剂中添加的增强剂可以使得这种发光增强一千倍。此光经X光胶片或者电子装置感光记录下来，可清晰显示蛋白质或核酸条带。

增强型ECL化学发光底物检测原理图

使用方法：

1.印迹膜制备：执行常规电泳、转膜、HRP标记的抗体或者HRP标记的核酸探针孵育、洗膜；ECL工作液含有HRP催化的发光底物，检测系统必须基于HRP酶标记的抗体或者核酸探针。充分的洗涤对于降低背景非常重要，所有步骤均在室温下完成。

2.ECL工作液的配置：在使用前取等量A液和B液，充分混匀后尽快使用；将膜片置混合液中，于室温下孵育约2分钟，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆盖全膜片，注意不要在膜片表面形成气泡。

3.蛋白或核酸信号显现：

1).用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸上以吸去过量试剂，仅留下少量液体覆盖表面，不可让膜完全干燥；

2).将膜片置于保鲜膜上，吸附蛋白面朝上，小心赶尽气泡；

3).用电子装置感光，或在暗室中用X光片曝光；

4).根据信号强弱适当调整曝光时间，也可选择不同时间多次曝光，以取得更佳效果。

应用^[4][5]

用于SIRT3对小鼠心肌肥厚中线粒体脂质代谢障碍及纤维化的影响及机制研究

构建小鼠心肌肥厚模型：给予8周龄雄性小鼠（年龄匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠）以胸主动脉缩窄术（TAC）。我们采用戊巴比妥钠对动物进行麻醉,将胸主动脉从周围组织中分离出来,于两侧颈总动脉之间放置27号空针针头（27-gauge needle）然后进行手术缝线结扎,迅速将针头移除。除结扎外,假手术组动物被给予相同处理。所有动物在术后6周处死,将小鼠心脏取材进行肥厚指标和脂质分析等方面的研究。

免疫组织化学：取材后,组织切片进行HE染色观察形态,进行Masson染色来评估胶原含量。胶原含量采用自动图像分析软件（Image Pro Plus）进行定量分析。

细胞培养、转染及处理：大鼠肌母细胞系H9C2（cardiac myoblast）购于ATCC,于含5%CO2的37℃孵箱中培养。所有病毒转染实验使用感染复数（multiplicity of infection,MOI）为10的病毒量进行转染。应用去氧肾上腺素注射液（PE,20μm）刺激H9C2细胞系48小时构建体外心肌细胞肥厚模型。

细胞内油红0染色及胆固醇、甘油三酯定量分析：用10%的多聚甲醛固定细胞90分钟,随后在油红O染液中孵育3小时后于显微镜下观察细胞内脂质累积情况；细胞内胆固醇和甘油三酯定量分析采用酶比色试剂盒（Wako）进行测定。

蛋白质免疫印迹：将冻存的心肌组织和处理的细胞用裂解液裂解,提取总蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,湿转法将蛋白转移到PVDF膜上,封闭后用特异性一抗4℃孵育过夜,然后二抗室温2小时。ECL化学发光液显影目的蛋白条带,LAS-4000化学发光仪检测。

参考文献

[1]Relation of left ventricular mass and geometry to morbidity and mortality in uncomplicated essential hypertension.Koren M J,Devereux R B,Casale P N,Savage D D,Laragh J H.Annals of Internal Medicine.1991

[2]SIRT3 is a stress-responsive deacetylase in cardiomyocytes that protects cells from stress-mediated cell death by deacetylation of Ku70.Sundaresan Nagalingam R,Samant Sadhana A,Pillai Vinodkumar B,Rajamohan Senthilkumar B,Gupta Mahesh P.Molecular and Cellular Probes.2008

[3]SnoN as a novel negative regulator of TGF-beta/Smad signaling:a target for tailoring organ fibrosis.Zeglinski MR,Hnatowich M,Jassal DS,Dixon IM.American journal of physiology Heart and circulatory physiology.2015

[4]Contribution of oxidative metabolism and glycolysis to ATP production in hypertrophied hearts.Allard M F,Schnekess B O,Henning S L,English D R,Lopaschuk G D.The American journal of physiology.1994

[5]陈桐帅.SIRT3对小鼠心肌肥厚中线粒体脂质代谢障碍及纤维化的影响及机制研究[D].山东大学,2015.