菜豆凝集素(PHA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

菜豆凝集素(PHA)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中凝集素(PHA)水平。

用纯化的凝集素(PHA)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入凝集素(PHA)，再与HRP标记的凝集素(PHA)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的凝集素(PHA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中凝集素(PHA)浓度。

菜豆凝集素(PHA)结构

操作步骤

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

应用^[4][5]

用于豆类凝集素的提取分离及纯化研究

选取23种不同种属、不同地区的食用豆类，对凝集素的总活力及特异性活力进行测定及考察；以小黑芸豆为例，探讨了粗提取因素对凝集素提取的影响，确定了硫酸铵分级沉淀的饱和度范围，并通过DEAE-52及S-200纯化得到凝集素纯品；

通过提取、分离及纯化得到了4种芸豆凝集素的纯品，并测定出凝集素亚基的分子量。

对23种不同食用豆类的水溶性蛋白含量、总活力及特异性活力进行测定，探讨了种属、地域对于豆类凝集素的总活力及特异性活力的影响。并以小黑芸豆为例，考察了种籽不同部位的凝集素分布情况。

实验结果表明菜豆属的豆类总活力及特异性活力整体较高，最高的为红芸豆，有两种芸豆未表现出凝集活性；豇豆属及大豆属的凝集素总活力及特异性活力显著低于菜豆属；

子叶中凝集素总活力及特异性活力均最高，种皮中无凝集素检出。此外，以小黑芸豆为例研究了粗提取条件，确定硫酸分级沉淀范围及DEAE-52、S-200的实验条件；纯化4种芸豆凝集素并测定了分子量。

参考文献

[1]C-type lectin receptors and cytokines in fungal immunity[J].Simon Vautier,Donna M.MacCallum,Gordon D.Brown.Cytokine.2011(1)

[2]Purification,Characterizations of a Snake Guard Seeds Lectin with Antitumor Activity Against Ehrlich Ascites Carcinoma Cells In Vivo in Mice[J].Syed Rashel Kabir,Md.Farhadul Islam,Md.Jahangir Alom,Md.Abu Zubair,Nurul Absar.Protein and Peptide Letters.2012(3)

[3]Structural and functional diversity of the lectin repertoire in teleost fish:Relevance to innate and adaptive immunity[J].Gerardo R.Vasta,Mihai Nita-Lazar,Barbara Giomarelli,Hafiz Ahmed,Shaojun Du,Matteo Cammarata,NicolòParrinello,Mario A.Bianchet,L.Mario Amzel.Developmental and Comparative Immunology.2011(12)

[4]Purification,characterization,structural analysis and protein chemistry of a buffalo heart galectin-1[J].Ghulam Md Ashraf,Sabika Rizvi,Shoa Naqvi,Nida Suhail,Nayeem Bilal,Shirin Hasan,Mohammad Tabish,Naheed Banu.Amino Acids.2010(5)

[5]王超.豆类凝集素的提取分离及纯化[D].哈尔滨工业大学,2013.