棉花基因组DNA提取试剂盒的应用

背景^[1-3]

棉花基因组DNA提取试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取植物的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效、专一吸附DNA，可限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的植物基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

棉花基因组DNA琼脂图

操作步骤：

使用前先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、植物组织预处理：取新鲜植物组织（不超过100mg）或干重组织（不超过20mg），于液氮中充分研磨至细粉状，让液氮自然挥发。

2、将研磨好的植物组织粉末迅速转移到预先装有400ul溶液PA、20ul RNase A（10mg/ml）和5ulβ-巯基乙醇的离心管中，充分颠倒混匀，室温放置10min。

3、加入140ul溶液PB，充分颠倒混匀，12000rpm离心10min，将上清转移至新离心管中(约400-500ul)，注意不要吸入沉淀。

4、加入和上清相同体积的溶液PC，充分颠倒混匀，再加入和溶液PC相同体积的无水乙醇，此时若出现絮状物，将絮状物吹散后一起加入吸附柱中，12000rpm离心5min，弃废液，一次加不完可分两次加入。

5、向吸附柱中加入600ul漂洗液(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。

6、向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min。

7、将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，否则残余的乙醇可能会影响后续的实验如酶切、PCR等。

8、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置

1-5min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的植物基因组DNA。

9、(可选)离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min。

应用^[4][5]

用于棉花DNA分子标记连锁图谱构建及基因定位研究

以陆地棉多标记基因系T582和T586为亲本，通过杂交获得的F2群体作为构建棉花分子连锁图谱的作图群体，应用SSR和AFLP两种比较新颖的分子标记方法进行了研究。

通过反复实践和摸索，建立了棉花基因组DNA提取、PCR反应和DNA多态性检测等技术体系；构建棉花分子连锁图谱框架，与此同时对若干基因进行了定位。

具体研究内容概括如下：1棉花DNA提取方法的探讨提取植物基因组DNA有两种基本方法，即SDS法和CTAB法，在原方法基础上进行适当改进，常分别冠以改进（改良）的SDS法和改进（改良）的CTAB法。

以棉花不同部位的材料为研究对象，进行了四种提取DNA方法的比较研究，其中改进的SDS法与原SDS法相比主要有三点不同：（1）．次取上清之前先用氯仿／异戊醇（24：1）抽提一次，再用异丙醇沉淀；（2）．改高速离心得到DNA小丸为挑取絮状DNA；（3）．提取缓冲液中加入1-2％PVP。改进的CTAB法与原方法相比也有三点不同，其中最主要的一点是：溶解于高盐溶液（1.4mmol／L NaCl）中的CTAB与核酸复合物，不是采用降低溶液盐浓度（0.7mmol／LNaCl）的办法来析出DNA，而是直接采用加入0.6-1倍体积的异丙醇的方法来获取可见的絮状DNA；另外两点改进之处与改进的SDS法相同。

参考文献

[1]Development of RGA-CAPS markers and genetic mapping of candidate genes for sugarcane mosaic virus resistance in maize[J].M.Quint,R.Mihaljevic,C.Dussle,M.Xu,A.Melchinger,T.Lübberstedt.Theoretical and Applied Genetics.2002(2-3)

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[3]Genetic mapping of 66 new microsatellite（SSR）loci in bread wheat[J].P.Gupta,H.Balyan,K.Edwards,P.Isaac,V.Korzun,M.R?der,M.–F.Gautier,P.Joudrier,A.Schlatter,J.Dubcovsky,R.De la Pena,M.Khairallah,G.Penner,M.Hayden,P.Sharp,B.Keller,R.Wang,J.Hardouin,P.Jack,P.Leroy.Theoretical and Applied Genetics.2002(2-3)

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[5]孙志栋.棉花DNA分子标记连锁图谱构建及基因定位[D].浙江大学,2003.