HT-1080人纤维肉瘤细胞的应用

背景^[1-3]

HT-1080人纤维肉瘤细胞来源于一位35岁男人的纤维肉瘤及结缔组织的纤维肉瘤细胞，细胞形态为上皮细胞样贴壁生长，HT-1080细胞含有活化的N-ras癌基因。

细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

传代方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。

3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。

应用^[4][5]

用于雷公藤内酯醇对人纤维肉瘤HT-1080细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响及其机制研究

研究雷公藤内酯醇（TL）对人纤维肉瘤HT-1080细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达的影响。

方法1.选择人纤维肉瘤细胞系HT-1080为研究对象,常规培养、传代,药物的3个工作浓度分别为6nM、12nM和18nM,处理时间均为72小时;

2. 采用MMT法检测TL对HT-1080细胞增殖能力的影响;

3. 用流式细胞仪检测TL致HT-1080细胞凋亡情况;

4. 运用RT-PCR检测TL对9个基因mRNA表达的影响,这些基因是:MMP-9和-2,基质金属蛋白酶组织抑制物（TIMP）-1、-2、-3和-4,DNA甲基转移酶（DNMT）-1、-3A和-3B;

5. 用明胶酶谱实验检测TL对HT-1080细胞MMP-9和-2活性的影响;

6. 用Transwell侵袭实验检测TL对HT-1080细胞体外侵袭能力的影响;

7.用甲基化特异性PCR（MSP）检测TL对MMP-9基因甲基化水平的影响;8.用Western blotting检测TL对DNMT-1、-3A和-3B蛋白表达的影响。

结果1.TL作用72小时,随药物浓度的增加,HT-1080细胞的增殖逐渐受到抑制;其中,半数抑制浓度约为25nM;

2. 浓度分别为6 nM、12 nM和18 nM的TL处理72小时后,HT-1080细胞的凋亡率分别为16.0%、17.3%和18.8%,对照组凋亡率为17.7%;

3.18 nM TL处理HT-1080细胞72小时后,MMP-9 mRNA的表达明显下调（P＜0.05）,但MMP-2、TIMP-1/-2/-3/-4 mRNA的表达无明显变化（P均＞0.05）;6 nM和12 nM TL处理组上述基因的mRNA表达均无明显变化（P均＞0.05）;

4.12 nM TL处理HT-1080细胞72小时后,在细胞无血清培养基上清中检测到的MMP-9的活性明显下调（P＜0.05）,18 nM TL处理组无血清培养基上清中则基本检测不到MMP-9（P＜0.01）;3个药物处理组MMP-2的活性均无明显变化（P均＞0.05）。

参考文献

[1]The other side of MMPs:Protective roles in tumor progression[J].Michelle D.Martin,Lynn M.Matrisian.Cancer and Metastasis Reviews.2007(3)

[2]The Effect of Triptolide on Apoptosis of Glioblastoma Multiforme(GBM)Cells[J].J Lin,L-Y Chen,Z-X Lin,M-L Zhao.Journal of International Medical Research.2007(5)

[3]Sulfated glucosamine inhibits MMP-2 and MMP-9 expressions in human fibrosarcoma cells[J].Niranjan Rajapakse,Eresha Mendis,Moon-Moo Kim,Se-Kwon Kim.Bioorganic&Medicinal Chemistry.2007(14)

[4]Methods for detecting DNA methylation in tumors:From bench to bedside[J].David S.Shames,John D.Minna,Adi F.Gazdar.Cancer Letters.2007(2)

[5]杨盛波.雷公藤内酯醇对人纤维肉瘤HT-1080细胞基质金属蛋白酶-9表达的影响及其机制研究[D].中南大学,2008.