果胶酶分离纯化的方法有哪些？

【背景及概述】^[1][2][3]

随着分析手段的不断提高，人们进一步了解到果胶的分子结构并开发出相应酶类，从而使果胶酶的应用进入一个新的蓬勃发展时期，其应用已不再停留在最初的饮料加工上，而是在粮油加工、纺织、造纸、化妆品等行业都有所发展，在与天然产物提取相关的精细化工、医药等领域也有了阶段性的进展，果胶酶的固定化研究也正在逐步深入。能分解果胶质的酶被称为果胶酶。目前，国内外在果胶酶方面的研究正在广泛深入地进行。果胶酶工业应用的商业利润促进了对其研究及开发，全界有很多厂商生产果胶酶制剂，并且随着技术的进步，令生产成本下降，应用的范围也越来越广。果胶酶广泛分布于高等植物和微生物中，在某些原生动物和昆虫中也有发现。在微生物中，细菌、放线菌、酵母和霉菌都能代谢合成果胶酶。果胶酶一般分为原果胶酶、果胶水解酶、果胶裂解酶和果胶酷酶等。目前果胶酶在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域得到广泛应用。

【分布】^[1]

果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称，果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以糖苷键聚合而成的多糖链!常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子、特别是与硼化合物结合在一起。果胶结简图如下：

许多霉菌及少量的细菌和酵母菌都可产生果胶酶，主要以曲霉和杆菌为主。 新近报道的其它菌有青霉如意大利青霉、扩展青霉以及Penicilliumgriseoroseum等，白绢菌、立枯丝核菌、微小毛霉、高大毛霉、热解糖梭菌、匐枝根霉、出芽短梗霉、粗糙链孢霉嗜热侧孢霉等。由于真菌中的黑曲霉属于公认安全级，其代谢产物是安全的，因此目前市售的食品级果胶酶主要来源于黑曲霉，最适pH 值一般在酸性范围。近年来，一些来源于细菌杆菌属的碱性果胶酶日益受到重。随着分子生物学技术的不断提高，也可利用基因克隆技术实现胶酶在其它微生物宿主的表达。

【分类】^[1]

果胶酶大致分为果胶水解酶、果胶裂解酶、果胶酯酶和原果胶酶等，其中果胶水解酶又可分为聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸甲酯水解酶、聚鼠李半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木糖基半乳糖醛酸酶等，由于人们对PG 的认识最早、应用最广泛，因此早先常被称为果胶酶。为避免发生概念混淆，国际上常用Pecto lytic Enzyme 来代替Pectinase。

【分离纯化】^[2]

果胶酶分离纯化的方法有很多种，可根据具体情况选择应用。

1.粗酶液的制备

粗酶液的制备通常来自：1）无细胞的微生物培养基上清液；2）含有果胶酶的植物组织浸出物；3）微生物感染植物后该植物组织浸出物。种方法来源于微生物的酶，如果是细胞外酶，粗酶液制备比较简单，即通过过滤或离心去除菌体即可。如果是细胞内酶，则需要利用超声波法、酶解法、碱、去垢剂法以及研磨法等破碎细胞，使酶释放出来。对于第二、第三种方法从植物组织提取酶，需要对植物组织进行匀浆。提取过程保持低温对酶的稳定有益处。此外盐浓度、缓冲液成分以及pH都对提取的收率有影响。用磷酸钠溶液成功提取了来自西红柿的内切果胶酸盐裂解酶，并用含氯化钠的乙酸缓冲液提取了地钱植物组织中外切聚半乳糖醛酸酶。

2.硫酸铵盐析

制得的粗酶液，通常需要进行硫酸铵盐析沉淀。一般采用60 %～ 90 %饱和度的硫酸铵分离来自B。Subti lis的果胶裂解酶在F.pectinororum 果胶裂解酶粗酶液加55 %～85 %硫酸铵饱和度可以使99 %的裂解酶分离出来而比活性大大提高。从马铃薯病原体Fusarium roseum 中60 %～80 %硫酸铵沉淀组分经透析得到大部分裂解酶，进一步提纯可使比活性提高117 倍。用硫酸铵将来自Phomamedicaginisvar pinodella 的果胶裂解酶纯化了6倍。采用85 %饱和度的硫酸铵盐析法将来自Cort icium rol f si i 的聚半乳糖醛酸酶纯化了8 倍，酶收率52 %。用硫酸铵盐析法从Aspergi llus japonicus 中提取了果胶裂解酶，酶收率达87 %。

3.有机溶剂沉淀

另一种用于初步提纯、浓缩果胶酶的方法是有机溶剂沉淀法，通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙醇和丙酮。同硫酸铵盐析比较，使用有机溶剂沉淀酶的缺点是造成酶部分失活。将来自Botry tis cinerea Pers 的果胶酯酶与聚半乳糖醛酸酶分别用20 %和66 %的丙酮沉淀，将这两种酶分别纯化了5 倍和6 倍。

4.层析

果胶酶经过硫酸铵盐析和有机溶剂沉淀后，可采用离子交换层析法进一步提纯。分离来自Phy tophthora infestans 的果胶酯酶采用了CM-纤维素柱层析法，在pH6.5 条件下以10mmol/ L 磷酸钠溶液平衡，再用线性梯度的氯化钠溶液平衡，得到两个果胶酯酶的峰，分离效果较好。DEAE-纤维素也是分离酶的良好载体，同样也已被成功地用在分离果胶酶研究上。另外，亲和层析在酶的分离中也有一定应用。

5.其他方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳作为一种分析手段已被用于检测制备果胶酶的均一性。分离来自Cytophagejohnsoni i 的果胶裂解酶在pH 8.6 和pH 4.3 都显示了单一带，说明已获得了均一的蛋白。通过圆盘电泳在pH 8.9 对胡萝卜果胶酶分析走出一条带说明纯化是成功的。等电聚焦法也被应用到纯化果胶裂解酶。用等电聚焦法分析来自phoma medicaginisvar pinodella 的果胶裂解酶，得到一条带，与传统的圆盘电泳结果一致。Sephadex 凝胶过滤法也是果胶酶纯化过程常用的手段之一。选择不同Sephadex 可以达到分离果胶酶的目的。超离心技术也已被广泛应用到检测纯化的果胶酶均一性和测定该成分的沉降系数。来自酵母的聚半乳糖醛酸酶经纯化后用超离心方法确证其单一的活性成分。由于不同来源的果胶酶成分复杂，给分离带来一定困难，因此高效液相色谱作为一种快速有效的分析分离方法在酶分离纯化上也得到一定的重视与研究.

【应用】^[1][3]

1. 利用果胶酶瓦解植物细胞的细胞壁

1）果蔬汁的生产，果酒的澄清：目前，在大部分的原果汁、浓缩果汁的生产过程中，都在使用果胶酶。 由于各种水果中果胶的含量差别较大，而且果胶质的成分也略有差异，因此，要根据不同品种、不同加工目的来确定果胶酶的酶组成。 由于PG 的专一性对果胶的酯化度要求不如PL 高，在澄清果汁方面往往注重以PG 为主的酶组成，而在提高浸出汁，特别是自流汁方面往往注重使用以PL 为主的酶制剂。

2）天然产物的提取：天然色素如葡萄紫、番茄红、紫苏紫、萝卜红等均可使用酶法提取，但所用果胶酶不得含有花青素酶等杂酶以免影响某些产品色泽。其次，天然生物活性物质提取物是目前中药进入国际市场的一种理想方式，出口比例已超过中药，并呈上升趋势。可利用果胶酶生产的提取物有：银杏叶提取物、大蒜油浓缩液、蘑菇浓缩液、人参浆、当归浸膏、甘草液等。另外，在金耳多糖、香菇多糖、金针菇多糖、山楂叶总黄酮等的提取中也使用了果胶酶。利用酶类提取，不仅可提高萃取率，还可提高纯度。另外，在油料萃取方面，按照传统的生产工艺，菜籽油、棕榈油、葵花籽油、橄榄油等一般是由正己烷等脂溶性溶剂萃取制得，而正己烷是一种致癌物质。将果胶酶和纤维素酶、半纤维素酶结合使用，可破坏油料作物的细胞壁，便于油料的释放，从而提高萃取率。由于酶法提取条件温和，油料中多酚物质和VE 都有所增加，从而提高油料的稳定性。

3）纺织品的生物脱胶：用碱性果胶酶处理，代替碱对棉、麻等织物进行煮练加工和整理工艺，以去除初生胞壁中的果胶物质，在比较缓和的pH值和温度条件下使处理后的织物手感柔软，强度高，取代了耗能大、污染严重的传统热碱脱胶工艺。另外，可避免因微生物处理造成的纤维素的降解。

4）造纸业的生物制浆：造纸工业中的生物制浆与纺织品的生物脱胶类似，都是通过果胶酶等酶处理降解植物纤维原料中的果胶、半纤维素及木质素，使其分散成满足造纸工业不同要求的束纤维或单纤维，以生产柔软、均一、有弹性的高品质材料。由于纸浆中高分子果胶带负电荷，经酶降解至六糖以下即可将其除去，避免了成品纸的静电现象。

2. 部分分解细胞间质中的果胶物质

1）带果肉食品的生产：一般常规加工所得到的果肉在必要的高温处理或机械泵出后，成型颗粒量明显减少，硬度降低，直接影响了产品品质。果胶质在PE 作用下脱去甲氧基，在钙离子存在下形成凝胶，从而保持了果肉原有的形状和硬度。以此为基料的产品有果汁、果冻、果肉酸奶、果肉冰淇淋等。

2）单细胞产品的生产：所谓单细胞产品是指将生物组织进行转化而形成的完整的单细胞悬液。酶法降解植物细胞间质中的果胶物质产生完整的单细胞悬液的过程称为浸解作用。在浸解过程中，一方面设法使内源性果胶酯酶灭活，避免细胞软化；另一方面，用外源果胶酶适度降解胞外果胶及其它成分，避免胞内物质泄漏，降低品质。工艺常用于生产带肉果蔬汁饮料、乳制品的配料、即食的干燥土豆泥、胡萝卜泥等食品，以及芦荟、人参、越橘叶、红花等美容保健品的配料。

3. 利用果胶酶生产果胶低聚糖

1）以果胶为底物生产低聚果胶：PG 可水解细胞壁中的果胶成分产生聚合度为10 左右的寡聚半乳糖醛酸，后者是植物防御反应的诱导因子，防御作用包括产生有抗真菌活性的抗毒素，抑制蛋白合成的抑制剂等等，而且当endo-PG 与其抑制蛋白结合以后可进一步激活此防御反应，所以PG 在植物致病、抗病中具有双重作用。 某些中草药中的药用成分也与果胶成分有关，如艾草叶中的果胶成分是一种生物活性成分，柴胡根中的抗溃疡糖类与果胶分子中的RG-II有关，而人参叶中的RG-II也具有抗溃疡作用，柴胡根中的RG-I能够促进鼠B 细胞产生I L-6，增进机体免疫力，苍术根中的果胶片段具有肠道免疫活性。此外，果胶酶解产物还具有抑菌活性，可显著抑制乳酸菌的生长；还可作为功能性食品的配料。

2）以几丁质、几丁聚糖为底物生产低分子寡糖：PG 可水解几丁质、几丁聚糖的β-(1，4)-糖苷键，得到水溶性寡糖。这类低分子寡糖具有多方面的生理功能，如抗肿瘤、抗菌、增强免疫机能，改善肠道微生物区系的分布，刺激有益菌的生长等。另外，几丁寡糖可作为保水剂、抗菌剂、植物生长调节剂等应用于农业、食品和化妆品业。

【主要参考资料】

[1] 薛长湖, et al.果胶及果胶酶研究进展. 2005. PhD Thesis.

[2]  贾月, et al. 果胶酶分离纯化及分析方法的研究进展. 工業微生物, 2005, 35.1: 55-58.

[3]  李琦, et al. 果胶酶应用的研究进展. 中国农学通报, 2014, 30.21: 258-262.