LS174T细胞的应用

背景^[1-3]

LS174T细胞是LS 180结肠腺癌细胞株的胰蛋白酶化变种。它比亲本更易传代，像LS 180一样生成大量的癌胚抗原(CEA)。电镜研究表明，它有丰富的微丝和胞浆黏液素液泡；血清学检测直肠抗原3阳性；p53抗原表达阴性，但mRNA表达阳性；角蛋白阳性；癌基因c-myc、N-myc、H-ras、N-ras、Myb和fos的表达呈阳性；癌基因k-ras和sis的表达未做检测；可产生IL-10、IL-6和黏蛋白。

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

应用^[4][5]

用于HDAC抑制剂对LS174T细胞组蛋白乙酰化及ASC基因表达的作用研究

研究去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(sodium butyrate,NaBu)对人结肠癌LS174T细胞中的组蛋白H3乙酰化水平以及对抑癌基因ASC表达的影响,从而探讨丁酸钠在细胞凋亡诱导和结肠癌治疗中的可行性。

方法:剂量组使用1、5、10 mmol/L浓度的NaBu分别作用LS174T细胞24小时,时间组使用5 mmol/L NaBu作用LS174T细胞12、24、48、72小时。提取细胞的mRNA和总蛋白,采用RT-PCR技术检测ASC基因表达情况,同时使用免疫印迹技术(Western blot)检测组蛋白H3的乙酰化水平及ASC蛋白的表达情况。

MTT用于检测细胞增殖率,并使用DAPI染色和AnnexinV-FITC方法测定细胞凋亡情况。

结果:随着NaBu作用浓度的增加组蛋白H3乙酰化程度不断增加,使用相同浓度NaBu作用细胞不同时间时,结果显示药物作用时间与组蛋白的乙酰化程度呈正相关。

ASC基因和蛋白的表达也同样受其影响,并且ASC表达的恢复和上调引起LS174T细胞增殖率下降和凋亡增加。

结论:NaBu对组蛋白H3乙酰化的调节具有时间和剂量依赖性,NaBu能够上调LS174T细胞组蛋白H3的乙酰化水平,降低细胞增殖率,促进抑癌基因ASC的表达和细胞凋亡。

参考文献

[1]HIC1(Hypermethylated in Cancer 1)epigenetic silencing in tumors[J].Capucine Fleuriel,Majid Touka,Gaylor Boulay,Cateline Guérardel,Brian R.Rood,Dominique Leprince.International Journal of Biochemistry and Cell Biology.2008(1)

[2]Histone deacetylase regulation of immune gene expression in tumor cells[J].A.Nazmul H.Khan,Thomas B.Tomasi.Immunologic Research.2008(2)

[3]Histone deacetylase inhibitor Trichostatin A induces global and gene-specific DNA demethylation in human cancer cell lines[J].Biochemical Pharmacology.2007(9)

[4]Apicidin,a novel histone deacetylase inhibitor,has profound anti-growthactivity in human endometrial and ovarian cancer cells[J].Tami Ueda,Noriyuki Takai,Masakazu Nishida,Kaei Nasu,Hisashi Narahara.International Journal of Molecular Medicine.2007(2)

[5]柏景乔.HDAC抑制剂对LS174T细胞组蛋白乙酰化及ASC基因表达的作用[D].大连医科大学,2009.