T4 DNA连接酶的链接特性及运作原理

背景及概述^[1]

即T4 DNA连接酶。DNA连接酶（EC6.5.1.1）用于体外DNA连接、连接检测PCR，体内冈崎片断连接成完整基因组DNA有重要作用。基因工程所用DNA连接酶由公司提供，最常用的是T4 DNA连接酶（T4Lig）。

连接酶分子大小^[1]

T4 DNA连接酶由T4嗜菌体30基因合成，最早从T4嗜菌体感染的E。coli提取。后来发现DNA复制缺失型嗜菌体中连接酶产量更高，从而作为连接酶的主要来源，目前市场供应连接酶通过基因工程方法生产。Murry测定T4 DNA连接酶分子量为63000~68000Da，Armstrong进一步确定为55，230Da，由487个氨基酸（Aa）残基组成，基因长度1464bp（GenBank序列号为X00039）。按照分子量与分子大小比例关系估算，T4 DNA连接酶大小约3。4nm，可跨越约1个DNA双螺旋长度（即10bp）。连接酶占据连接端口下游（5’-P端部）7~10bp，占据端口上游（3’-OH端部）3~5bp。只有487Aa的酶分子同时具有连接活性，拓扑异构活性表明其结构、功能比较复杂。与之相比，E.coli DNA连接酶671Aa，分子量74000Da，每个E.coli细胞含有约300个DNA连接酶分子，与DNA聚合酶分子个数接近，可以满足DNA复制时冈崎片断连接需要，细菌和真核生物中冈崎片断长度分别为1000bp左右和100~200bp。

连接酶保真性^[1]

相对于DNA聚合酶，连接酶保真性不太熟悉，特别是DNA体外连接的科研人员。连接酶保真性是指酶分子识别连接端口核苷酸的能力。T4 DNA连接酶识别连接端口碱基能力较低，从而连接多种异常端口：3’或5’无嘌呤或无嘧啶碱基、缺失1nt的连接端口、3’和5’A-A或T-T配对、5’G-T配对、3’C-A、C-T、T-G、T-T、T-C、A-C、G-G、G-T配对。连接反应中加入亚精胺（spermidine）、高盐缓冲液，或降低连接酶用量可以提高T4 DNA连接酶保真性。Wu等发现100nMDNA在1UT4 DNA连接酶，200mM高盐浓度下保真性可提高60倍。随着保真性提高，Km增加4倍，Vmax降低~30倍。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DNA连接酶保真性较高，可识别1nt缺失端口和3’A-G或T-G配对端口，但是识别5’A-C、T-C、C-A、G-A匹配能力不高。5’-P端部核苷酸识别能力较低可能与5’-P-AMP复合物的形成有关。与常温作用的T4 DNA连接酶连接酶（37℃）不同，有些高温作用的DNA连接酶：Pyrococcus furiosus（Pfu）连接酶、Thermus aquaticus（Taq）连接酶、Thermus thermophilus（Tth）连接酶、Thermotoga maritima（Tma）连接酶。Taq DNA连接酶反应温度45~65℃，Tma DNA连接酶反应温度60℃。Taq DNA连接酶保真性比T4 DNA连接酶、E.coli DNA连接酶高很多。TthDNA连接酶保真性比T4 DNA连接酶高24倍。Tth DNA连接酶具有3’-5’外切活性，可以切去与模板非匹配碱基。Tth DNA连接酶的保真性较高，可能与Tth DNA聚合酶3’-5’外切活性较低有关，高温菌T.thermophilus DNA合成中很少掺入错配碱基，需要Tth DNA连接酶切去冈崎片断连接时错配碱基。TthDNA连接酶中K294R和K294P突变后，既保留了该酶的切口DNA连接活性，又提高了保真性约4倍和11倍。T4 DNA连接酶识别错配碱基能力较低，可能与T4 DNA连接酶的3’-5’外切活性有关。

连接机理与结构^[1]

目前DNA连接反应机理是基于切口双链DNA底物得到的：普遍认为连接反应由三步完成：①T4 DNA连接酶先由ATP供能产生E-AMP复合物；②E-AMP复合物识别双链DNA切口位置，将AMP转移到5’-P基团，形成5’-P-AMP复合物；③3’-OH亲核攻击5’-P-AMP形成磷酸二酯键，并释放出AMP。在PDB数据库（October 2015 Release）检测不到T4 DNA连接酶的晶体结构，导致连接机理不完全明了，特别是平端DNA连接机理不完善。以热稳定性Pfu DNA连接酶晶体结构为模板，笔者通过同源分子建模模拟T4 DNA连接酶结构（图1）。显示出DNA连接酶有三个保守性结构域：DNA结合结构域DBD（DNA-binding domain，M1~L129），腺苷酰化结构域AdD（adenylaition domain，I130~E368），寡核苷酸链结合结构域OBD（oligonucleotide-binding-fold，V369~E482）。腺苷酰化结构域AdD中K159是腺苷酰化位点，通过该位点形成N6-AMP-lysine酶-底物复合物。根据相似性比对发现，R164、R182、R359、K365是ATP结合位点，E217、E344二价金属离子结合位点（UniProtKB登录号：P00970）。Rossi等切除T4 DNA连接酶N-端80个Aa、C-端57个Aa、C-端137个Aa分别得到NΔ80、C-Δ57、C-Δ137突变体，酶学性质表明N端80个Aa、C端57个Aa在DNA结合中起重要作用。模拟结构显示N端M1~L129是DBD结构域，C端V369~E482是OBD结构域（图1），均与DNA结合有关。端部切除显示E-DNA复合物有两种状态：腺苷酰化酶分子复合物的短暂态（T·complex）：是指ATP将AMP转移到连接酶K159上形成E-AMP复合物；去腺苷酰化态酶分子复合物的稳定态（S·complex）：是指E-AMP复合物将AMP转移到连接端口5’-P基团形成5’-P-AMP复合物，需要寻找附近的3-OH，所以此时E-DNA复合物是一种稳定态，稳定态复合物与平端连接有关。K159是T4 DNA连接酶酶分子腺苷酰化作用位点，K159L突变体表明K159不参与识别DNA、但是K159L突变后酶分子不能完成自身腺苷酰化。在AMP存在下，K159L突变体具有DNA内切活性，可以将超螺旋质粒DNA切成环状切口DNA，解除DNA超螺旋。

平端连接效率^[1]

Sgaramella检测到T4 DNA连接酶具有平端连接功能。T4 DNA连接酶以切口双链DNA为底物时动力学参数显示Kcat=0.4s^-1，Kcat/Km=1.5×10⁸M^-1s^-1，以粘性末端、平端DNA为底物时Km值分别为0。6μM、50μM，表明T4 DNA连接酶对切口比平端端口DNA亲合力高5个数量级，所以平端DNA连接时需要高出10倍的酶量。在T4RNA连接酶存在时，T4 DNA连接酶连接平端DNA效率接近于粘性末端DNA。T4 DNA连接酶连接平端DNA效率很低，加入高浓度血清白蛋白、聚乙二醇（PEG：polyethyleneglycol）、Ficoll0、高氯化钴能提高平端连接效率。PEG存在时，大鼠肝细胞核连接酶和E。coli连接酶也能连接平端DNA，发现加入32%PEG200后E.coli连接酶具有平端连接功能。PEG存在时，提高温度有利于分子连接。粘性末端需要碱基间互补匹配的氢键作用，16℃过夜连接更有效。平末端不需要氢键作用，在20℃较高温度下容易形成磷酸二酯键。DNA浓度高于0.3nM容易形成分子间连接、主要用于基因克隆。DNA浓度低于0.3nM时容易形成分子内连接，主要用于质粒DNA分子自身环化，DNA分子内平端连接可以高效构建重组质粒。目前分子内连接主要用于突变研究，如Quickchange、TaKaRa Mutan BEST Kit突变、原位易错PCR一步构建突变体文库等。因为平端连接效率很低，为了将平端转换为粘性末端，在DNA端部引入限制性酶切位点，通过酶切后产生粘性匹配末端以提高连接效率。为了避免限制性酶切效率的限制，通过T载体、PEASY-载体、拓扑异构酶连接载体等粘性连接载体，进一步，开发了无限制性酶切的PCR方法连接载体，利用噬菌体同源重组酶的同源基因克隆方式，Gibson连接方式是利用T5外切酶产生粘性匹配末端，由Phusion DNA聚合酶将缺口补齐，而后由Taq DNA连接酶连接端口。

平端连接反应检测^[1]

DNA连接需要三个步骤完成，ATP将AMP转移到酶分子K159上，而后E-AMP复合物识别DNA双链切口位置，将AMP转移到端口5’-P形成5’-P-AMP复合物，在酶分子作用下由3-OH亲核攻击形成磷酸二酯键。通过下列几种方式检测连接端口是否形成二酯键。1）限制性内切酶检测：经限制性酶切的质粒DNA经4Lig连接后，能够用相同的限制性酶切开，说明T4 DNA连接酶将平端DNA连接成双链。2）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）抗性检测：碱性磷酸酶能够从线性DNA端部降解核苷酸，酶连产物如果能抗碱性磷酸酶消化，则表明单个DNA分子连接成多聚物。电泳可以检测DNA单体是否形成了多聚体，但是只能检测是否存在多聚体，不能证明是否形成磷酸二酯键。3）碱变性检测：经高温变性或碱变性后，重新恢复到非变性环境，不同构型的DNA分子有不同表型。环状DNA能保持环状形态，但是线性（或环状切口）DNA则会在碱变性后成为“bushes”［18］。笔者电泳检测发现碱变性后线性DNA分子还是处于变性前的条带位置，可能分子量相同而构型不同。4）DNA环化后转化率检测：完整质粒经化学方法转化可产生104个转化子/ng，检测DNA环化后能否达到此种转化率，从而证明DNA连接后是否形成完整质粒。电泳能够检测DNA连接产物是否产生超螺旋条带，但是必须≥10ng才能检测出来。不同限制性酶切出的平端连接效率不同，Rusche发现Bsu限制性酶切割SPPI/pSC101 DNA产生的DNA在15~25℃连接效率大约达到75%。但是连接产物转化后，只达到<4%质粒转化率，说明质粒DNA经酶切后再连接不能形成完整质粒。笔者发现平端DNA连接后转化率约为4%，表明DNA连接形成质粒的效率不高。在超螺旋质粒DNA中加入T4 DNA连接酶，会发生RF1和RF2构型的转换，4h后有5%质粒DNA是RF1构型，由T4 DNA连接酶拓扑异构活性产生。

连接酶平端连接的理性改造^[1]

硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）双链DNA结合蛋白Sso7d具有底物结合活性，将其融合Pfu DNA聚合酶，保留了DNA扩增的保真性，同时提高了聚合酶3’-5’外切活性，从而切去与模板非匹配碱基，提高了聚合酶持续合成能力。高保真的Phusion、Q5DNA聚合酶同样融合了DNA结合结构域，从而提高了聚合酶持续合成能力。因为T4 DNA连接酶对平端DNA连接效率很低，其理性改造是融合DNA结合结构域。Wilson等为了提高T4 DNA连接酶连接酶对底物结合力，进行了Sso7d与连接酶的融合研究。融合Sso7d后，T4 DNA连接酶对平端DNA连接活性提高了60%。融合人工合成的家鼠-人类嵌合型转录因子cTF后，T4 DNA连接酶对平端DNA和载体连接效率提高160%。融合人类转录因子NF-kBp50-后，E.coli DNA连接酶的连接效率也得到明显提高。

主要参考资料

[1]贺添艳,刘亚娟,徐文选,刘猛,刘亮伟。T4DNA连接酶性质及其平端连接功能[J]。河南科学,2016,34(07):1058-1062。