STABLE感受态细胞的特点及应用

背景^[1]

STABLE感受态细胞是采用大肠杆菌Stable菌株经特殊工艺处理得到的感受态高转化效率菌株，是逆转录病毒/慢病毒载体系统推荐使用的菌株。基因型：F'proA B lacIq∆(lacZ)M15 zzf::Tn10(TetR)∆(ara-leu)7697 araD139 fhuA∆lacX74 galK16 galE15e14-Φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL(StrR)rph spoT1∆(mrr-hsdRMS-mcrBC)。

特点^[2]

1.Stable菌株是是逆转录病毒/慢病毒载体系统推荐使用的菌株，具有与Stbl2，Stbl3完全不同的基因型，但是表现出比Stbl2，Stbl3更优异的性能，特别适合慢病毒或具有末端重复序列DNA片段的克隆。2.含有recA1 rel A1突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率。3.含有核酸酶endA1突变，避免提取质粒过程中核酸酶的污染，提高了提取病毒质粒的产量和质量。4.含有lacZΔM15，可用于蓝、白斑筛选。

操作方法^[3]

1.Stable感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，6分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置5分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入0.9 mL室温S.O.C.或LB培养基(S.O.C.营养丰富，可提高转化效率)。

4.30℃，250 rpm复苏60分钟。

当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19计算转化效率

则需37℃，225 rpm复苏60分钟

5.筛选平板提前拿出放30℃孵育使平板温度保持30℃，吸取50-100μl直接涂筛选平板或5000 rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的S.O.C.或LB培养基上。

6.将平板倒置放于30℃培养20-24小时或37℃过夜培养。

当质粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19计算转化效率，

则需37℃培养过夜

应用^[4][5]

用于E.coli高效感受态细胞转化体系的建立及诱导型瞬时表达载体的构建

以实验室种植的拟南芥为试材,通过引物的设计等技术克隆了拟南芥叶片中的诱导型启动子rd29A片段,通过测序等比对,分析了启动子中间的不同响应元件。同时利用启动子rd29A和载体PBI221构建了诱导型植物瞬时表达载体,并通过了酶切检测。本试验的主要结果如下:1.试验比较了不同方法制备的大肠杆菌感受态细胞的转化效率,并优化了质粒DNA转化感受态细胞的转化体系。

结果表明,应用高效法制备的感受态细胞其转化效率极显著高于普通大肠杆菌感受态细胞,转化效率提高了966.1%。-80℃超低温长期保存时,以7%DMSO为冻存保护剂保存的感受态细胞其转化效率最高,达到1.1×107,较15%甘油冻存保护剂保存的转化效率提高了69%。温浴5 min,冰浴10 min时,其转化效率最高,达到4.95×107。并且转化时间缩短至普通大肠杆菌感受态细胞的12.5%,仅为15 min。2.试验以拟南芥为试材,设计特异引物克隆得到了拟南芥诱导型启动子rd29A的基因序列,通过在GenBank上进行核苷酸序列的比对,分析了该启动子的各个响应元件。结果表示,序列的第370-375碱基之间有5 bp的TATA盒(TATAA),在第737-744碱基间有8 bp的戴帽信号序列(TCAGTCTC),在第302-305和353-356碱基间有CAAT盒和富GC区域(ATGGGCCAATAG)。

有文献曾经报道过的干旱响应顺式作用元件(DRE)(TACCGACAAT)这段序列位于第556-565碱基之间,而报道中的ABA响应元件(ABRE)(ACGTG)则位于第719-724碱基之间。3.试验构建了诱导型植物瞬时表达载体PBI221-rd29A。通过分析启动子的酶切位点,试验利用HindIII和XbaI对启动子基因片段进行双酶切处理,同时载体PBI221也用相同的限制性内切酶进行酶切处理,将处理产物在T4 DNA连接酶的作用下16℃进行过夜连接,其产物转化大肠杆菌感受态细胞,经过培养得到含有载体质粒的克隆子。提取所构建载体的质粒进行酶切检测,顺利释放800bp左右目的条带,证明载体构建成功。同时本试验还构建了含有水通道蛋白AQP的瞬时表达载体PBI221-AQP,为验证AQP基因的功能奠定了基础。

参考文献

[1]重组大肠杆菌DH5α生产rNGR-Tum-5工艺的研究[D].张怡洁.西北大学2009

[2]超高压处理对大肠杆菌DH5α遗传物质的影响[D].徐迪.合肥工业大学2007

[3]大肠杆菌DH5αupp基因的敲除及其应用研究[D].杨奇.南京理工大学2013

[4]孙尚琛.超声波介导质粒pUC19转化大肠杆菌DH5α感受态细胞转化方法及机制的研究[D].兰州理工大学,2016.

[5]杨坤. E.coli高效感受态细胞转化体系的建立及诱导型瞬时表达载体的构建[D].西北农林科技大学,2010.