Stable 感受态细胞的应用

背景及概述^[1]

大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，处于这种状态的细胞称作感受态细胞(Competent Cells)。Stable感受态细胞是采用Stable菌株经特殊工艺制备得到的感受态细胞。Stable菌株特别适用于具有末端重复序列的逆转录病毒或慢病毒质粒的构建和扩增，也适用于重复DNA序列的克隆和扩增。Stable具有与Stbl3和Stbl4完全不同的基因型，比Stbl3和Stbl4生长速度更快，性能更好。核酸内切酶 (endA1)基因的缺失有利于提高质粒DNA的产量和质量。ΔlacZM15基因的存在可用于蓝白斑筛选。菌株还具有抗T1噬菌体感染的特点。Stable感受态细胞经pUC19质粒检测转化效率>108 cfu/μg DNA。

菌株抗性^[1]

对氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、壮观霉素和呋喃妥因敏感。具有四环素和链霉素抗性。

储存条件^[1]

-70℃保存，避免反复冻融。不适合在液氮中保存。临床应用和适应症^[2]

应用^[2]

CN201510505278.9报道了应用Stable 感受态细胞构建含有ccdB的shRNA慢病毒干扰载体。

(1)制备载体骨架pLVX-EF1a-copGFP-Puro：

以pCDF1-MCS2-EF1-copGFP(SBI公司)载体为模板，PCR扩增得到EF1a-copGFP片段 (引物序列见表1)，用MluI和AfeI双酶切PCR产物，然后插入到同样经过MluI和AfeI双酶切 的慢病毒载体pLVX-Puro(Clontech公司)上，得到载体骨架pLVX-EF1a-copGFP-PGK-Puro。

(2)插入shRNA表达启动子：

用ClaI和XhoI双酶切步骤(1)得到的载体pLVX-EF1a-copGFP-PGK-Puro，去磷酸后 电泳回收；用ClaI和XhoI双酶切扩增hU6启动子的PCR产物后(引物序列见表2)，连接到 pLVX-EF1a-copGFP-Puro载体的相应位点上，转入大肠杆菌Stable 感受态细胞构中，涂LB平板，培养过夜，鉴定后得到的载体为pLVX-hU6-EF1a-copGFP-PGK-Puro。

(3)插入ccdB序列得到三引物退火shRNA慢病毒干扰载体：

以pLenti6载体(Invitrogen公司)为模板，扩增出含有大肠杆菌ccdB致死基因的 片段，将扩增的到的ccdB用XhoI和Mlu I双酶切后，与经过XhoI和Mlu I双酶切的pLVX-hU6- EF1a-copGFP-PGK-Puro载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB/amp平板，培养过夜， 进行菌落PCR及酶切鉴定，得到用于构建三引物退火shRNA的慢病毒干扰载体，载体骨架是 pLVX-hU6-ccdB-EF1a-copGFP–PGK-Puro。

主要参考资料

[1] Stable 感受态细胞说明书

[2] CN201510505278.9 用于制备shRNA的引物及制备方法、载体及构建方法