植酸酶及其应用

植酸酶是水解植酸及其盐类生成肌醇和磷酸的一类酶的总称。作为一种新型饲料添加剂，植酸酶在动物营养及环境保护等领域具有很大的应用潜力。综述了植酸酶的分类、来源、生产技术、提高产率的策略、分离纯化及应用等方面的研究进展，并对发展前景进行了展望。

植物组织中的磷主要是以肌醇六磷酸钠的形式存在，难以被单胃动物吸收。而且，肌醇六磷酸分子可以螯合金属离子，其作用相当于抗营养因子，抑制了营养的吸收。没有被充分的利用磷，通过动物排泄进入水体最终导致水体富营养化。解决磷这种循环方式的根本就在于解决磷的利用问题，因而在动物饲料中添加微生物植酸酶正在逐渐被推广和应用。

1996年FDA确认植酸酶在食品中应用是安全的，可在动物饲料中使用，植酸酶已成为第三大饲用酶。但是目前面临的主要问题是高昂生产成本和低植酸酶产率。近年来，对植酸酶的报道有很多，主要集中在分离、鉴定、高产菌的筛选、发酵工艺及植酸酶在畜牧业生产中的应用。本文主要对目前植酸酶的上游和下游工艺水平，以及其应用进行综述，包括发酵类型、菌株的改良等，下游技术包括分离、纯化和终产品应用等。

分类

植酸酶是对可水解植酸磷释放磷酸基团形成肌醇衍生物的一类酶的总称，属于磷酸单酯水解酶。广义植酸酶包括三种类型：肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶(3-植酸酶)，肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶(6-植酸酶)及非特异性的正磷酸酯磷酸水解酶(酸性磷酸酶)，该类酶可将肌醇磷酸脂彻底分解成肌醇和磷酸。

Mullaney和Ullah根据植酸酶结构上的差异将植酸酶分为组氨酸酸性磷酸酶、β-螺旋植酸酶和紫色酸性磷酸酶。同时植酸酶还可根据酶的最适pH可分为酸性植酸酶、中性植酸酶、碱性植酸酶。酸性植酸酶的最适pH比较符合单胃动物胃酸性环境，因此一直是植酸酶研究的重点。例如，A. ficuum NRRL3135 分泌的酸性植酸酶由于其酶活力和耐热性好被看成是最有应用前景的饲用植酸酶，作为首个上市的饲用植酸酶制剂，其能明显降低猪和家禽粪便的磷水平。该酶的最适pH为2.5~5.5，因此主要应用于胃环境呈酸性的单胃动物中。中性植酸酶主要来源于芽孢杆菌属，适合消化道呈中性的单胃动物。碱性植酸酶最早是在香蒲和百合的花粉中被发现的，在微生物中也有产生该类植酸酶的菌种。

2 提高植酸酶产率策略

2.1 菌种的诱变

植酸酶生产中，一些经过诱变处理的细菌如Lactobacillus amylovorus、E. coli、B. subtilis、B. amyloliquefaciens、Klebsiella spp.等已经被广泛应用。王淘等以放射型根瘤杆菌为出发菌株，进行紫外-氯化锂复合诱变，筛选到一株产中性植酸酶酶活性较高的菌株。该菌株产中性植酸酶活力最高达到18.49U/ml，比原始菌株提高47.68%(P<0.01)，且发酵周期也缩短了12h，同时菌株表现良好的遗传稳定性。Chelius和Wodzinski对A. niger NRRL 3135进行紫外诱变得到比野生型酶活大3.3倍的菌株，该突变菌株可以释放60%的无机磷，但是在初步筛选中由于对植酸酶和酸性磷酸酶分辨缺乏特异性、敏感性，因而他们的研究方法具有限制性。

2.2 基因工程菌

通过基因工程技术手段构建植酸酶高产菌株已成为植酸酶研究的发展趋势。在合适的宿主中克隆和表达植酸酶基因可以进一步提高植酸酶产量。付石军将地衣芽孢杆菌ZJ-6编码的植酸酶基因(PhyC)定向的插入到原核表达载体pET-30a+中，将重组质粒在E.coli中进行表达，表达产物经过亲和层析纯化后比活为2.87U/mg。同时他还将地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶成熟肽基因(phyCm)以N端融合方式插入到酵母表达载体，电击转化入毕赤氏酵母中，发酵上清液中重组植酸酶比活为8.64U/mg，较原始出发菌株产酶活力有大幅度提高。许钦坤等根据毕赤酵母基因的密码子选择偏爱性，对植酸酶phyA基因进行定点突变，构建含有正突变的酵母表达载体，并通过电击转化进入毕赤酵母中，经发酵酶活力高达136 900U/ml。目前，植酸酶基因已经在酵母、细菌、真菌、植物等多种表达系统中成功表达(表 2)。

2.3 原生质体融合技术

原生质体融合对菌株的潜能提升明显，目前已经被应用到大多数工业微生物中。但是在植酸酶研究领域，原生质体融合技术只见少数报道。谢凤行等以产植酸酶芽孢杆菌诱变的突变株Z56和产纤维素酶芽孢杆菌复合诱变的突变株X57为亲本，利用双亲灭活原生质体融合技术进行原生质体的融合,成功构建了可产植酸酶、纤维素酶的工程菌。结果通过筛选得到的两个融合子的植酸酶产量相对较高，且植酸酶对热的稳定性明显增强，90℃处理10min，剩余酶活分别为对照的73%和71%。

Gunashree和Venkateswaran[41]利用原生质体融合技术，将营养缺陷型黑曲霉CFR335和无花果黑曲霉SGA01原生质体经过紫外诱变处理之后进行种间融合，通过杂交获得了高稳定性、植酸酶产量大的菌株。由此可见，原生质体融合技术在提高植酸酶产量上是一种有效的技术手段。

3 植酸酶分离纯化技术

3.1 预处理和浓缩

对于胞外酶，发酵液经离心过滤，上清液进行硫酸铵分级沉淀或超滤等法进行浓缩；胞内酶需要破碎细胞后分离，使用醇、丙酮沉淀，硫酸铵沉淀浓缩法。很多研究者通过硫酸铵沉淀法分离植酸酶，收率分别达到16.8%、50%、78%。盐析、有机溶剂沉淀、超滤等方法都已经成功用于植物、细菌和真菌植酸酶的前期分离纯化中。

3.2 层析纯化

层析技术具有分离步骤少、专一性强、活力损失小的优点，是植酸酶分离纯化的主要技术。何海燕等对米曲霉发酵液经Quix-StandTM Benchto PSYSTEM纤维过滤浓缩和MonoQ10/l00GL强阴离子纯化柱层析纯化，两步纯化分离出米曲霉A-1的植酸酶Phy A1，相对分子质量约为45×103，纯化倍数达33.4。Nabil等对B.subtilis MJA 产的植酸酶进行分离纯化研究表明，DEAE琼脂糖离子交换层析是植酸酶分离纯化中最重要的步骤，该步收率达70.5%，酶纯化1.9倍。而凝胶过滤层析作为纯化的最后一步，最终可使酶纯化4倍，收率为57.7%。

3.3 植酸酶的固定化

固定化植酸酶能够提高酶的稳定性和活性，解决饲料添加中酶活性降低和稳定性不足的问题。王成波将商用植酸酶固定于壳聚糖载体上，以其为载体，以戊二醛为交联剂，利用共价结合方法，对植酸酶的固定化进行探究。研究表明，植酸酶固定化条件为戊二醛浓度4%、加酶量65U/g、交联时间5h，酶活力达到1 665U/ml。Menezes等将Aspergillus niger、Escherichia coli产的植酸酶固定于脲基化合物分子和纳米黏土中，固定化之后的两种酶在更低的酸性条件下表现稳定，同时增强了它们对热的稳定性以及对蛋白酶的水解抵抗作用。

饲料制粒过程中的高温降低了植酸酶的热稳定性，酶固定化中如何保持酶稳定性仍然是值得深入研究的问题。

4 植酸酶的国内外市场状况及其应用研究

植酸酶最主要的应用是作为饲料添加剂提高磷的利用率，减少环境中磷的排放。随着植酸酶需求量的不断增加，欧洲国家(丹麦、荷兰等)均已经出台规定要求加大微生物植酸酶的应用。当前，植酸酶正被大量运用到不同的生物技术领域。

4.1 植酸酶的国内外市场状况

在国内，植酸酶产品经历了20世纪90年代的引入期，到近年的高速发展期，市场已逐步走向行业整合期。目前生产6-植酸酶的生产厂家己从最初的几家增至几十多家，生产能力则从最初500多吨增加到5 000多吨以上，这其中规模较大的有四、五家，产能在2 000t以上，占国内市场份额的50%~60%。2006年植酸酶产值1.43亿元，占酶制剂产值的30.8%。2007年国内植酸酶产品的销售总量是1.2万吨，销售额达1.44亿元(单价：12 元/kg)，其中用于配合饲料使用的为9 300万吨。2009年，中国饲料工业发布的“十一五”发展的具体目标是：2015年，配合饲料年双班生产能力达到1.7亿吨左右，浓缩饲料产量达到3 000万吨，添加剂预混合饲料产量达到600万吨。而在2010年，饲用酶的市场估值已达10亿美元。这预示着植酸酶作为极其重要的饲料添加剂其需求量将会持续增长。

20世纪80年代荷兰等欧洲国家就已经开始着手对植酸酶进行研究开发。到90年代初欧盟各国、美国等发达国家就已规定养殖业须强制使用植酸酶，日本、韩国等国也均规定把植酸酶产品作为一种“绿色磷”取代传统无机磷酸盐。2002年国内植酸酶产品生产厂家极少，3-植酸酶产品几乎由国外企业生产供应，并一直维持高价位销售。2003年国内3-植酸酶产品的生产技术得到突破，使其价格从最初的300元/kg降低到80元/kg，因此对国外产品造成冲击。2006年伴随国内对6-植酸酶产品的规模使用，全球范围内的3-植酸酶产品再度降价。2008年，欧洲动物添加剂和预混料协会发布消息：磷资源匮乏需加大对植酸酶的使用，这使得植酸酶产品需求量陡增。当前，全球范围内普遍使用植酸酶，全球植酸酶市场潜力如按饲料工业产量推算，约为6.5万吨。因而，植酸酶的使用不仅具有显著的经济效益，而且具有巨大的生态效益，其在饲料工业中的推广势在必行。而中国植酸酶产业在饲料添加剂领域的发展日渐成熟，在科研、创新和应用等方面也形成了较完整的体系，已经发展成为最为完善的饲用酶制剂产业。

4.2 饲料工业中的应用

植酸酶作为饲料添加剂已经广泛应用到猪、家禽、鱼饲料中，多数研究中发现，植酸酶可以释放磷酸盐中的磷。同时因其可提高不同营养物质的利用度，不同来源的植酸酶常被单独或混合使用在饲料工业领域中。饲用植酸酶已经成为工业酶产业中增长势头最快的一类且正呈逐年上升之势。

Simons等的研究已经表明在玉米、豆粕日粮中添加植酸酶，可使磷的利用率提升60％，粪便中磷的排出量减少了50%。Waldroup等报道，以豆饼为日粮的肉鸡饲料中加入植酸酶，大约有50%植酸磷得以释放。邱梅平和王恬研究在肉鸡的玉米-豆粕型日粮中添加植酸酶，增加了蛋鸡的肠绒毛高度、黏膜厚度，降低肠隐窝深度，进而优化了肠道结构，增强了小肠对营养物质的吸收。值得注意的是，2009年由中国农业科学院生物技术研究所培育的转植酸酶基因玉米获得生产应用的安全证书，是世界例获得生产应用许可的转植酸酶基因玉米。该转植酸酶基因玉米加工成饲料后仍然保留了大部分植酸酶活性，可分解饲料中的植酸，不但可释放出无机磷，还可减少饲料中磷酸氢钙的添加量，减少动物排泄物中磷的排放。

4.3 食品工业中的应用

在人类食品中添加植酸酶，市场上还没有相关的食品开发报道。谷物中存在的植酸可抑制很多矿物的吸收，在人的小肠里植酸酶活性非常低，难以利用食物中的植酸盐。此外，虽然人的小肠黏膜中具有植酸酶和碱性磷酸酶，但在植酸盐的降解中却不起作用，所以食物中的植酸酶在水解植酸盐过程中扮演重要角色。体外模仿生理条件的实验表明，植酸酶通过对植酸的水解可使铁的利用率提高67％~98％。此外，植酸对锌的利用率也有影响。在体内，锌离子和植酸形成螯合物，降低了其利用率。谷物食粮中植酸存在是造成人体缺锌的因素之一。因而在食品中添加植酸酶可有效增强它们的营养价值。Hurrell研究了在面粉中加入植酸酶应用的可能性，发现植酸酶可以快速降解面粉中的植酸。Tovar等在龙舌兰酒中加入从细菌中分离的植酸酶，可以有效改善铁和锌的吸收。

4.4 作为土壤改良剂

对农作物而言，磷是一种基本营养元素，土壤中30%~80%的磷是以有机磷的形式存在，有机磷中植酸磷占了约50%，能被植物利用的非常少。很多植物可以产胞外植酸酶，如烟草、番茄、苜蓿等，可降解周围土壤中的植酸盐以供生长所需。在植物生长环境中加入可产生植酸酶的菌种或者添加植酸酶可增强植物对植酸磷的利用。植酸酶菌株可高效水解土壤中的植酸磷，促进了土壤中的稳定有机磷向活性有机磷转化。候文通等研究了转植酸酶(phyA2)基因玉米根系分泌的植酸酶对土壤磷素的有效性和作物磷积累量的影响。实验表明，三种转基因玉米根系植酸酶活性远高于阴性对照，可显著提高根际土壤磷酸酶活性从而增加了植株对根际土壤有机磷的利用。

4.5 促进植物生长中的应用

Gujar等研究发现，微生物(黑曲霉)植酸酶可以减少土壤中30%的植酸，可使植酸利用度增加1.18倍。苏毅等探究表明，施加不同量的植酸酶后，其增加了黄瓜苗的株高、玉米苗的株高及茼蒿的叶绿素含量，三种植物幼苗的生长状况与植酸酶用量呈正相关。其中四株玉米苗处理组的株高比对照组分别增加22.50%、66.27%、27.15%、74.87%(P<0.05)，处理组的黄瓜苗株高比对照组增加30.43%，6株茼蒿中的叶绿素含量比对照组分别增加17.43%、38.98%、46.26%、58.58%、78.35%、99.04%。

4.6 其他应用领域

低磷酸肌醇在植物和动物细胞的跨膜信号传导及从胞内动员钙离子的过程中扮演重要角色。与化学合成相比，植酸酶在合成磷酸肌醇方面非常高效，并且专一性高、成本低，因而可应用于磷酸肌醇的生物合成中。磷酸肌醇及其同分异构体在预防糖尿病的并发症、抗炎症方面展示了很好的药理特性，它还可通过控制高胆固醇和动脉粥样硬化改善心脏病的发病症状。此外，Saito等研究发现，植酸酶还可用于提高大豆中免疫性强的两种抗原蛋白β-2伴豆球蛋白(β-conglycinin)和大豆球蛋白(glycinin)的分离效率。因此可以预见，植酸酶的应用领域将会越来越广泛。

5 前景与展望

磷作为地球物质循环不可或缺的元素，如果不加以合理的利用和开发，势必对食品和水资源安全产生威胁。而随着磷酸盐全球需求的增长，植酸酶的应用将进一步扩大。植酸酶作为环境友好型的制剂在减少磷的使用量中具有重要意义。传统的植酸酶生产和纯化方法有很多缺点，因而需要谋求不同的策略来发展高效的植酸酶生产工艺。例如，自动化图像分析技术对真菌形态学的研究将有助于提升植酸酶的产率、研发新的快速经济的酶分离纯化方法、提升现有工艺水平。固定化技术在植酸酶储存和使用的过程中保持酶活性仍然是很值得关注的问题。此外，应用基因工程和蛋白质工程的方法对植酸酶进行改造，也是植物酶研究中的重要方向。可以预见，随着科技的不断发展，植酸酶工业将展现突飞猛进的增长势头。

来源：中国生物工程杂志