大鼠膀胱上皮细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠膀胱上皮细胞来自于膀胱组织，其主要作用有：(1)组成过滤屏障内壁的重要部分。(2)在炎症和致血栓物质的刺激合成必要的生物活性分子。(3)受损后影响系膜细胞和上皮细胞，进而产生病变。公司提供的大鼠膀胱上皮细胞，采用胶原酶消化制备而来。膀胱壁由三层组织组成，由内外为粘膜层、肌层和外膜。其中，粘膜层为极薄的一层移行上皮组织，和输尿管及尿道黏膜彼此连贯。体外培养膀胱上皮细胞不仅为组织工程膀胱，尿道提供种植细胞的必要手段，也是研究移行上皮细胞肿瘤发生和治疗的基础与前提，进而可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。

细胞特性^[4-6]

大鼠膀胱上皮细胞的基本特性：

（1）组织来源于正常大鼠膀胱组织。

（2）鉴定：vWF,Factor VIII,CD31(P-CAM)

（3）原代细胞培养末期液氮冻存。

（4）每冻存管细胞数：>5×105 cells/1ml。

（5）vWF/Factor VIII和CD31(P-CAM)验证。

（6）不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

应用^[7][8]

用于氯胺酮性膀胱纤维化中TGF-β1调控膀胱上皮细胞EMT的实验研究.。

长期滥用毒品氯胺酮(ketamine)会引发膀胱间质炎症(ketamine-induced cystitis,KC),主要临床表现为尿频、尿急、尿痛、排尿困难及急迫性尿失禁等。膀胱纤维化是中晚期KC患者的严重并发症。膀胱壁由于纤维结缔组织积聚而发生重塑,引起膀胱纤维化、挛缩,使其变为小容量、高压力的低顺应性膀胱,导致膀胱贮尿和排尿功能障碍,进一步发展会导致上尿路积水和肾功能损害,危及生命。目前少有研究涉及ketamine引发膀胱纤维化的机制。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)是指上皮细胞失去极性、在形态学上向间质细胞转变的生物学过程。目前已证实EMT广泛参与肾脏、肝脏、肠壁及肺脏的纤维化,并已成为有效终止、逆转脏器纤维化的重要靶点,然而其在膀胱纤维化中的作用尚未见报道。

本项目拟从EMT介导器官纤维化入手,结合体内外模型,通过分子机制研究阐明TGF-β1信号通路介导的EMT在KC纤维化发生发展中的机制。

方法

1.建立KC大鼠模型并探讨EMT与膀胱纤维化的关系雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠18只,体重180-200g,随机分为3组,每组6只,分别为对照组(Control),ketamine低剂量组(LK,30mg/kg),ketamine高剂量组(HK,60mg/kg)。每日腹腔注射ketamine溶液或生理盐水,持续16周。采用代谢笼记录24h饮水量和尿量。采用排尿印迹法评估尿频情况。对大鼠行尿动力检查,记录排尿收缩次数、逼尿肌不稳定收缩次数、膀胱内压力(基线值,阈值,值)、排尿量、膀胱容量,计算膀胱顺应性。处死大鼠后取膀胱组织,制作石蜡切片,HE及Masson染色评估膀胱上皮损害及间质纤维化情况,免疫组化实验评估E-cadherin、Collageon I、Vimentin、Fibronectin表达情况,E-cadherin-FSPl免疫荧光共定位评估膀胱上皮EMT发生情况。

2.在KC大鼠模型中,明确TGF-β1特异性阻断剂SB505124对EMT及膀胱纤维化的调节作用雌性SD大鼠24只,体重180-200g,随机分为4组,每组6只,分别为对照组(control),ketamine(KET,60mg/kg)组,ketamine+SB505124(SB)组,戒断组(abstinence组)。SB组在注射ketamine的基础上每周腹腔注射SB505124(10 mg/kg)一次,abstinence组注射ketamine后12周戒断4周。排尿印记、尿动力检查、HE染色、Masson染色、免疫组化分析同部分,免疫荧光双标检测E-cadherin-FSP1、E-cadherin-α-SMA共表达情况。

3.Ketamine通过TGF-β1调节人膀胱上皮细胞EMT的分子机制研究培养人永生化膀胱上皮(SV-HUC-1)细胞,CCK-8法检测ketamine(5-125μg/ml)对细胞活力的影响。Ketamine(125μg/ml)刺激SV-HUC-1细胞72h,相差显微镜观察细胞形态变化。

参考文献

[1]Ketamine Increases Permeability and Alters Epithelial Phenotype of Renal Distal Tubular Cells via a GSK‐3β‐Dependent Mechanism[J].Hsin‐Yi Shyu,Chun‐Jung Ko,Yu‐Chen Luo,Hsin‐Ying Lin,Shang‐Ru Wu,Shao‐Wei Lan,Tai‐Shan Cheng,Shih‐Hsiung Hu,Ming‐Shyue Lee.J.Cell.Biochem..2016(4)

[2]Urocortin Attenuates TGFβ1‐Induced Snail1 and Slug Expressions:Inhibitory Role of Smad7 in Smad2/3 Signaling in Breast Cancer Cells[J].Lai Jin,Chao Zhu,Xiaofei Wang,Chuanhua Li,Chunxuan Cao,Jie Yuan,Shengnan Li.J.Cell.Biochem..2015(11)

[3]Possible pathophysiology of ketamine‐related cystitis and associated treatment strategies[J].Jia‐Fong Jhang,Yung‐Hsiang Hsu,Hann‐Chorng Kuo.Int.J.Urol..2015(9)

[4]Long-term ketamine abuse induces cystitis in rats by impairing the bladder epithelial barrier[J].Di Gu,Jun Huang,Youle Yin,Zhengfei Shan,Shaobin Zheng,Peng Wu.Molecular Biology Reports.2014(11)

[5]TGF-β1 induces EMT reprogramming of porcine bladder urothelial cells into collagen producing fibroblasts-like cells in a Smad2/Smad3-dependent manner[J].Syed S.Islam,Reza Bayat Mokhtari,Yaser El Hout,M.A.Azadi,M.Alauddin,Herman Yeger,Walid A.Farhat.Journal of Cell Communication and Signaling.2014(1)

[6]Cardiac matrix:A clue for future therapy[J].Paras Kumar Mishra,Srikanth Givvimani,Vishalakshi Chavali,Suresh C.Tyagi.BBA-Molecular Basis of Disease.2013(12)

[7]Increased apoptosis and suburothelial inflammation in patients with ketamine‐related cystitis:a comparison with non‐ulcerative interstitial cystitis and controls[J].Cheng‐Ling Lee,Yuan‐Hong Jiang,Hann‐Chorng Kuo.BJU Int.2013(8)

[8]王俊鹏.氯胺酮性膀胱纤维化中TGF-β1调控膀胱上皮细胞EMT的实验研究[D].南方医科大学,2017.