人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)Elisa试剂盒是一种通过酶联免疫技术（Elisa）原理特异性识别样本中人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)的商品化试剂盒。人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)Elisa试剂盒可以通过识别样本中人结肠癌抗原(CCA)的类别及含量为科研及临床诊断提供依据。

需要注意的是若用于临床诊断的Elisa试剂盒需取得上市所在国的医疗器械资质。同时人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)Elisa试剂盒的诊断结论存在一定的局限性，受限于样本保存不当、实验操作不规范，方法学灵敏度等原因不能作为临床判断的唯一依据。

人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)Elisa试剂盒技术原理：方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)Elisa试剂盒

人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)Elisa试剂盒样品收集、处理及保存方法:

1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)Elisa试剂盒操作流程如下:

(1)待测样品孔中每孔加入待测样品100μl,每种样品设3个平行孔;设两个阴性对照孔,每孔加未处理组的细胞裂解液100μl;另设一个空白对照孔,加入纯细胞裂解液100μl。

(2)酶标板置4℃,包被过夜。

(3)洗板:吸干孔内反应液,用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去),之后将洗涤液注满板孔,浸泡1-2分钟,间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

(4)阴性对照孔每孔加入PBS 50μl,样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的抗体工作液50μl。

(5)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。

(6)洗板,同(4)。

(7)每孔加1:5000稀释的抗体工作液100μl。

(8)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。

(9)洗板,同(4)。

(10)每孔加TMB显色液100μl,轻轻混匀10s,置37℃暗处反应15-20min。

(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。

(12)分别测450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,测得的OD值为两者之差(W1-W2),以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

(13)数据处理:在得出标本(S)和阴性对照(N)的OD值后,计算S/N值。

应用^[4][5]

人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)Elisa试剂盒可以用于NE在非酒精性脂肪性肝炎kupffer细胞活化中的作用和机制以及黄连素对其影响

研究首先明确了PMNs在NASH早期炎症启动中的作用及其对kupffer细胞的活化作用；其次通过临床研究发现PMNs通过其分泌的中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)在NASH炎症中的重要作用,且升高的NE及其内源性抑制剂a1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,A1AT的降低可以作为NASH的预测因子；然后以NE抑制剂Sivelestat对NASH炎症和kupffer细胞活化进行了干预研究,并在体外直接证明了NE活化kupffer细胞的TLR4依赖机制；最后以黄连素(berberine,BBR)在NASH小鼠模型进行干预,发现通过降低NE活性并减少kupffer细胞活化可能是BBR治疗NASH的重要机制。

第一部分NE在NASH kupffer细胞活化中的作用和机制研究实验一PMNs介导早期kupffer细胞活化的研究目的明确中性粒细胞在NASH早期炎症启动中的作用及其在kupffer细胞活化中的作用。

方法：C57BL/6J小鼠分别以正常饮食(standard chow,SC)和蛋氨酸胆碱缺乏(methionine/choline-defecient,MCD)饮食喂养1,2,4,8周。中性粒细胞特异性抗体(Anti-Ly6G)用来耗竭小鼠外周血中性粒细胞。人多形核白细胞弹性蛋白酶(PMNElastase)Elisa试剂盒、CD68,F4/80免疫组化染色以及荧光定量RT-PCR用来检测kupffer细胞活化。结果在炎症早期(1-2周),注射Ab-Ly6G小鼠血清ALT水平显著低于注射IgG的对照组,肝脏脂肪变与炎症也明显减轻,但在炎症后期(第4、8周)耗竭外周血中性粒细胞不能明显减轻NASH小鼠的炎症。CD68,F4/80免疫组化染色以及荧光定量RT-PCR提示注射Ab-Ly6G能够延缓kupffer细胞的活化。

参考文献

[1]Berberine,a plant alkaloid with lipid-and glucose-lowering properties:From in vitro evidence to clinical studies[J].Angela Pirillo;;Alberico Luigi Catapano.Atherosclerosis.2015

[2]Leptin in nonalcoholic fatty liver disease:A narrative review[J].Stergios A.Polyzos;;Jannis Kountouras;;Christos S.Mantzoros.Metabolism.2015

[3]Increased Neutrophil Elastase and Proteinase 3 and Augmented NETosis Are Closely Associated With[Beta]-Cell Autoimmunity in Patients With Type 1 Diabetes[J].Wang,Yudong;;Xiao,Yang;;Zhong,Ling;;Ye,Dewei;;Zhang,Jialiang;;Tu,Yiting;;Bornstein,Stefan R;;Zhou,Zhiguang;;Lam,Karen SL;;Xu,Aimin.Diabetes.2014

[4]Non-alcoholic fatty liver disease as a cause and a consequence of metabolic syndrome[J].Hannele Yki-Järvinen.The Lancet Diabetes&Endocrinology.2014

[5]臧淑妃.NE在非酒精性脂肪性肝炎kupffer细胞活化中的作用和机制以及黄连素对其影响[D].浙江中医药大学,2016.