GV3101(pSoup-p19)感受态细胞的应用

背景^[1-6]

GV3101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。

pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti质粒含有筛选标签：gent，赋予GV3101菌株庆大霉素抗性；在GV3101菌株中转入help质粒：pSoup-p19即为GV3101(pSoup-p19)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGs2等质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tet）抗性。适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。本公司生产的GV3101(pSoup-p19)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pGs2(卡那霉素抗性)质粒检测转化效率>103 cfu/μg DNA。

p19蛋白来源于番茄丛矮病毒，可抑制宿主对外源基因的RNA沉默效应，提高异源基因转录本的稳定性，进而促进异源蛋白的表达，广泛应用于转基因植物及烟草叶片，拟南芥叶片，番茄叶片或原生质体的瞬时表达系统中。pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti质粒含有筛选标签：gent，赋予GV3101菌株庆大霉素抗性；在GV3101菌株中转入help质粒：pSoup-p19即为GV3101(pSoup-p19)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGs2等质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tet）抗性。适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。

操作方法：

1.取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上或室温融化。

2.每100μl感受态加0.01-1ug质粒DNA混匀，依次于冰水浴上静置10分钟、液氮5分钟、37℃5分钟、冰水浴5分钟。

3.加入700μl无抗生素的YEB或LB液体培养基，于28-30℃振荡140rpm培养2~3小时。

4.取所有的菌悬液涂布于含相应抗生素的YEB或LB平板上，28-30℃培养2-7天。

应用^[7][8]

GV3101(pSoup-p19)感受态细胞可用于水稻粒型基因SHG1的图位克隆及基因功能研究：

水稻是世界上重要的粮食产物。粒型是影响水稻产量最重要因素之一,因而,研究克隆影响籽粒长度的基因并阐明其分子机理,将会为通过分子手段培养高产水稻品种奠定坚实基础。以shgl为材料,开展一系列表型鉴定、图位克隆和基因功能等方面研究,主要研究内容如下:

1.shgl与野生型相比,籽粒粒长有显著的降低,粒宽和粒厚则有显著的升高,千粒重显著减少,株高降低,穗长缩短等表型。通过细胞学观察分析,shgl细胞长宽均显著低于野生型。

2.通过图位克隆的方法,将SHGl基因定位于33Kb区间之内,并通过测序其间的7个ORFs,发现shgl中的第四个ORF与野生型相比有单碱基突变并导致其转录的提前终止。通过生物信息学分析,SHG1属于OsKinesin蛋白家族,与狗尾草、大麦等单子叶植物同源蛋白亲缘关系较近,并且其马达结构域有很高的保守性。

3.通过构建SHGl基因的过表达载体,并转基因得到过表达株系。过表达株系籽粒长、宽均显著高于野生型,籽粒厚度则显著低于野生型,千粒重显著高于突变体,但低于野生型。

4.实时荧光定量PCR和GUS染色结果表明SHGl基因在水稻组织中具有较广谱的表达。通过水稻原生质体中SHG1蛋白的亚细胞定位发现SHG1蛋白是内质网定位蛋白。全转录组测序结果表明shgl突变体中差异基因主要分布在代谢、初级代谢、细胞性蛋白修饰、转运等类别。通过对细胞周期相关基因表达量的检测,发现shgl突变体中多个与细胞周期相关的基因表达量在突变体中发生明显变化,暗示其细胞分裂进程受到影响。

5.SHGl基因受到外源IAA刺激后表达量上调。通过双荧光素酶实验发现一些OsARFs可以结合SHGl的启动子区域增强转录活性。此外,相对于野生型,外源低浓度IAA对于促进shgl根伸长反应的效果不显著。6.通过一系列BR敏感性的检验,确定shgl是一个对外源BR较不敏感的突变体。与野生型相比,shgl突变体中BR合成和信号通路各基因表达模式有所改变,并且外源BR处理会抑制野生型中SHGl基因表达。

参考文献

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