EHA101感受态细胞的应用

背景^[1-6]

EHA101 Electro感受态细胞使用EHA101菌株为C58型背景制作，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101(pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。

pEHA101(pTiBo542DT-DNA)型Ti质粒含有筛选标签：strep、kan，赋予EHA101菌株链霉素抗性和卡那霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作，经pK7WGF2质粒检测转化效率可达104cfu/μgDNA。EHA101电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pK7WGF2质粒(壮观霉素抗性，size:11876 bp)检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pK7WGF2-ZH质粒（size:40 kd）检测转化效率可达5×103 cfu/μg DNA。

制备方法：

1.0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入1-5μg质粒DNA（质粒体积不大于6ul，用试剂盒抽提，双蒸水溶解），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。

3.启动电转仪，设置参数：C=25μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。

4.6000 rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有转化所用双元载体抗生素时，28℃培养48小时即可；平板中同时加入双元载体抗生素，20μg/ml rif时，需28℃培养60小时；如果使用的平板含有50μg/ml rif则需要28℃培养72-90小时）。

注意事项

1.加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

2.混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。

4.利福平浓度不应高于25μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。

5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失，但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。

应用^[7][8]

EHA101 Electro感受态细胞可用于植物基因克隆转化研究：

在玉米zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13的克隆与表达分析实验中以玉米郑58为材料,研究玉米zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13在植物响应非生物胁迫中的作用。qPCR结果表明,玉米幼苗在受到干旱、ABA、缺钾、NaCl、Na2CO3及低温胁迫时地上部分和地下部分的zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13都呈不同程度的上调或下调表达。

由此,可推测zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13可能与植物抗非生物胁迫相关。zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13在玉米的根、茎、叶、雄穗、花丝和种子中都有表达,且在雄穗、花丝和种子中表达量较高。由此,可推测zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13可能与玉米的生殖发育有关。通过PCR扩增的方法克隆得到319 bp的基因序列,其中包含134 bp的zma-miR169c前体序列,102 bp上游旁侧序列及83 bp下游旁侧序列。

Blastn比对结果表明zma-miR169c前体序列与miRBase中B73玉米的pre-miR169c的序列同源性为100%。构建了玉米表达载体ubi:zma-pre-miR169c,并采用冻融法将其转入农杆菌EHA101中。通过部分编码区的扩增、3’RACE和5’端PCR的方法克隆出长为1147 bp的ZmNF-YA13基因,其中ORF 822 bp,5’UTR 47 bp,3’UTR 278 bp,共编码273个氨基酸,其中3’UTR上含有zma-mi R169c的切割位点。氨基酸序列分析表明,其含有NF-YB/C结合区、DNA结合区及中间连接区这三个保守结构域。ZmNF-YA13氨基酸序列与其它植物来源的NF-YA3同源性为39%-72%。系统发育分析结果表明,ZmNF-YA13与小麦的TaNF-YA10的亲缘关系最近。

上述结果表明该基因为NF-YA家族成员。构建了玉米表达载体ubi:ZmNF-YA13(ORF)、ubi:ZmNF-YA13(ORF+3’UTR)和烟草表达载体35s:ZmNF-YA13(ORF),并采用冻融法将其转入农杆菌EHA101中。通过农杆菌介导的叶盘转化法将35s:ZmNF-YA13(ORF)转入烟草中,共获得6个转化株系。通过基因组PCR、RT-PCR及半定量RT-PCR检测转基因植株ZmNF-YA13基因的转入及表达情况,选择表达量较高的L3和L4株系用于后续干旱生理实验。

参考文献

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[8]尹鑫.玉米zma-miR169c及其靶基因ZmNF-YA13的克隆与表达分析[D].大连理工大学,2017.