小鼠肝外胆管上皮细胞的应用

背景^[1-6]

小鼠肝外胆管上皮细胞分离自肝脏组织；肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用；肝脏也制造消化系统中之胆汁。肝脏是机体内脏里的器官，位于机体中的腹部位置，在右侧横隔膜之下，位于胆囊之前端且于右边肾脏的前方，胃的上方。肝脏是机体消化系统中的消化腺，为一红棕色的V字形器官。

肝脏是尿素合成的主要器官，又是新陈代谢的重要器官。肝脏在机体位置和形态结构：肝脏位于右上腹，隐藏在右侧膈下和肋骨深面，大部分肝为肋弓所复盖，仅在腹上区、右肋弓间露出并直接接触腹前壁，肝上面则与膈及腹前壁相接。通过控制激素调控的分泌和吸收，在保持、调整和扩大胆小管的结构中发挥重要作用，肝内胆管上皮细胞在先天性和获得性免疫应答方面起着积极作用。肝内胆管上皮细胞约占肝细胞总数的5%，其在肝内胆道系统内形成复杂的网状管形结构。

肝内胆管上皮细胞具有复杂的生理代谢功能，参与肝脏的代谢、排泌、免疫等生理过程，在肝脏疾病的发生发展过程中起一定的作用。研究表明，常见的肝内胆管病变例如原发性硬化性胆管炎、胆管癌等疾病，都是以肝内胆管上皮细胞为病变靶位，进而引起肝内胆管上皮损伤。因此，了解正常肝内胆管上皮细胞的生物学特征和病变肝内胆管上皮细胞的病理特征对研究肝内胆管病变的发病机制、诊断和治疗具有重要意义。

应用^[7][8]

小鼠肝外胆管上皮细胞可用于肝外胆管系统中CD63~+干细胞的识别鉴定及其修复肝脏损伤能力的研究：

肝脏干细胞是一类具有自我更新能力并可分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的肝脏原始细胞,它们参与肝脏发育、生长和损伤修复与再生的过程。在前期的研究中,发现肝干细胞作为细胞移植的治疗用细胞与成熟肝细胞等其它类型细胞相比至少有以下优点:1)肝脏干细胞植入受体后增殖能力强并有重构肝干细胞巢的潜能;2)肝干细胞可以分化为肝细胞、胆管上皮细胞和其他间质细胞;3)体外对肝干细胞的培养和扩增比成熟肝细胞相对容易;4)肝干细胞为原始未分化状态细胞,相对于其他细胞,免疫原性很低。

对于小鼠肝外胆管系统的研究发现:

1)原位免疫组化染色显示,小鼠肝外胆管系统存在干性细胞,且这些细胞共表达肝干细胞分子标志CK19、EpCAM和Alb,但不表达间质相关分子标志αSMA;我们利用IV型胶原酶和胰酶联合处理消化小鼠肝外胆管组织,利用肝干细胞培养基Scm A可以将这些细胞在体外进行稳定扩增,且这些细胞在基因和蛋白水平均表达EpCAM、CK19、Alb、N-cadherin、Sox9、Pan-CK和E-Cadherin等肝干细胞分子标志,体外诱导分化实验表明这些细胞能被诱导分化为成熟肝细胞样细胞;

2)鉴于CD63可以作为肝内肝干细胞特异性的分子标志,我们首先在原位鉴定了小鼠肝外胆管组织中存在CD63+细胞,且这些细胞共表达肝干细胞分子标志EpCAM、CK19、Alb和Lgr5;继而通过流式分选将小鼠肝外胆管内CD63+细胞分离纯化后,基于前期建立的肝干细胞培养基条件,通过改良后添加生长因子:b FGF和VEGF,可以将这些细胞在体外稳定培养和增殖(大于30代);

3)通过抽提RNA和细胞免疫荧光染色实验发现,这些小鼠肝外胆管CD63+细胞在基因水平和蛋白水平表达CK19、Sox9和EpCAM等肝干细胞分子标志;

4)体外诱导实验显示,小鼠CD63+细胞可以被诱导为具有合成糖原、吲哚菁绿的摄入和排出及具有LDL受体等成熟肝细胞的功能和表型,以及能够形成囊管状结构(且囊管结构内的细胞具有极性)和运输罗丹明等成熟胆管上皮细胞的功能;

5)将标记了绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠CD63+细胞移植入延胡索酰乙酰乙酸脱氢酶(Fumarylacetoacetate hydrolase,Fah)基因缺陷(Fah-/-)小鼠模型中,发现这些细胞不仅可以分化为成熟肝细胞来再殖入受损的肝脏(再殖效率可高达19.69%),还可以分化为胆管上皮细胞(再殖效率可高达10.85%),这也是首次在Fah-/-小鼠体内观察到有移植的干细胞可以分化为胆管上皮细胞。说明小鼠肝外胆管系统中CD63+细胞确实是真正的干细胞,其不仅具有肝干细胞基本特性,而且具有较好的修复肝脏损伤的能力。

参考文献

[1]The Potential of Induced Pluripotent Stem Cell derived Hepatocytes[J].Zara Hannoun,Clara Steichen,Noushin Dianat,Anne Weber,Anne Dubart-Kupperschmitt.Journal of Hepatology.2016

[2]Direct reprogramming of hepatic myofibroblasts into hepatocytes in vivo attenuates liver fibrosis[J].Guangqi Song,Martin Pacher,Asha Balakrishnan,Qinggong Yuan,Hsin-Chieh Tsay,Dakai Yang,Julia Reetz,Sabine Brandes,Zhen Dai,Brigitte M.Pützer,Marcos Araúzo-Bravo,Doris Steinemann,Tom Luedde,Robert F.Schwabe,Michael Peter Manns,Hans R.Sch?ler,Axel Schambach,Tobias Cantz,Michael Ott,Amar Deep Sharma.Cell Stem Cell.2016

[3]The hematopoietic system in the context of regenerative medicine[J].Christopher D.Porada,Anthony J.Atala,Gra?a Almeida-Porada.Methods.2015

[4]Novel surface markers directed against adult human gallbladder[J].Feorillo H.Galivo,Craig Dorrell,Maria T.Grompe,YongPing Zhong,Philip R.Streeter,Markus Grompe.Stem Cell Research.2015(1)

[5]Bone marrow-derived mesenchymal stem cells suppress NK cell recruitment and activation in PolyI:C-induced liver injury[J].Mengmeng Qu,Jun Cui,Jun Zhu,Yuhong Ma,Xu Yuan,Jinming Shi,Deyin Guo,Changyong Li.Biochemical and Biophysical Research Communicatio.2015(2)

[6]Mesenchymal Cell Contributions to the Stem Cell Niche[J].Youmna Kfoury,David T.Scadden.Cell Stem Cell.2015(3)

[7]Basic fibroblast growth factor‐treated adipose tissue‐derived mesenchymal stem cell infusion to ameliorate liver cirrhosis via paracrine hepatocyte growth factor[J].Wei‐Ping Tang,Tomohiko Akahoshi,Jing‐Shu Piao,Sayoko Narahara,Masaharu Murata,Takahito Kawano,Nobuhito Hamano,Tetsuo Ikeda,Makoto Hashizume.J Gastroenterol Hepatol.2015(6)

[8]]姚浩.肝外胆管系统中CD63~+干细胞的识别鉴定及其修复肝脏损伤能力的研究[D].第二军医大学,2017.