GC-2 spd小鼠精母细胞系

背景^[1-6]

GC-2 spd小鼠精母细胞系来源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少数国内外大学建系。

GC-2 spd(小鼠精母细胞)常规培养传代流程（请严格遵守无菌操作）：

1.吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加1~2 ml 0.25%EDTA的胰酶消化（注意把握消化时间，通常控制在1~2min）。

2.镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁运动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉胰酶，加6~8ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落、吹散。

3.取出部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，于培养箱中培养。

4. 注意培养基PH值变化情况，定期换液，待细胞密度达到70-80%时重复传代操作或者冻存。

GC-2 spd小鼠精母细胞系常见问题及解决方案:

1对于生长缓慢的贴壁细胞：可采用适当的提高培养基中血清浓度，或隔日换液的方法来保证细胞的状态和生长速度。

2对于生长不均的贴壁细胞：在培养过程中若出现细胞分布明显不均时（即某一区域细胞已重叠生长，而旁边则为一块空白），此时可将细胞进行消化，重新打散，贴壁，加入新培养基进行培养。

3细胞漂浮：培养瓶不开封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。

次日观察GC-2 spd小鼠精母细胞系，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞活力正常，剩余漂浮的细胞可以离心去掉，留10ml培养液培养观察，细胞生长至汇合度80%，进行消化传代；如细胞还是不贴壁，将细胞离心收集转到新培养瓶，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察。

应用^[7][8]

GC-2 spd小鼠精母细胞系可用于研究 50Hz磁场暴露对生殖系统细胞DNA损伤的影响：

将雄性生殖系统来源的小鼠精原细胞(GC-1 spg)、精母细胞(GC-2spd)和雌性生殖系统来源的野生型仓鼠卵巢上皮细胞(CHO-K1)、二氢叶酸还原酶缺陷型仓鼠卵巢上皮细胞(CHO/dhfr-)分别暴露于50 Hz磁场24小时,采用γH2AX焦点免疫荧光成像法检测细胞γH2AX焦点形成,碱性彗星试验检测细胞DNA片段化水平,CCK-8法检测细胞活力,细胞计数法评估细胞增殖,以及PI染色、流式细胞术检测细胞周期进程。

此外,对50 Hz磁场暴露对双氧水诱导细胞DNA损伤效应的影响进行了初步探索。以雄性生殖系统GC-1 spg和GC-2 spd细胞为研究对象,我们获得了以下研究结果。

1)yH2AX焦点形成实验分析结果显示,与假暴露组相比,2.0 mT或3.0 mT的50 Hz磁场暴露组yH2AX平均焦点数均未发生显著性改变；碱性彗星实验结果显示,2.0 mT或3.0 mT的50 Hz磁场暴露均未显著引起GC-1 spg和GC-2 spd细胞内DNA片断化水平的改变。

2)CCK-8实验分析结果显示,3.0 mT(p<0.05)而非2.0 mT的50 Hz磁场暴露显著提高GC-1 spg细胞活力,2.0 mT或3.0 mT的50 Hz磁场暴露均未引起GC-2 spd细胞活力的显著改变；细胞计数实验结果显示,2.0 mT或3.0 mT的50 Hz磁场暴露对GC-1 spg或GC-2 spd细胞增殖均无显著影响；流式细胞术分析结果显示,2.0 mT或3.0 mT的50 Hz磁场暴露对GC-1 spg和GC-2 spd细胞周期分布均无显著影响。

3)2.0 mT的50 Hz磁场暴露未显著影响10μM双氧水处理诱导的GC-1 spg细胞yH2AX焦点数量增加,但2.0 mT的50 Hz磁场暴露显著促进10μM双氧水处理诱导的GC-2 spd细胞yH2AX焦点数量增加(p<0.05)；2.0 mT的50 Hz磁场暴露未显著影响10μM双氧水处理诱导的GC-1spg和GC-2 spd细胞DNA片段化水平改变。

以雌性生殖系统CHO-K1和CHO/dhfr-细胞为研究对象,我们发现,1)与假暴露组相比,2.0 mT或3.0 mT的50 Hz磁场暴露未能显著影响CHO-K1或CHO/dhfr-细胞yH2AX焦点形成；2.0 mT(p<0.05)非3.0 mT的50 Hz磁场暴露轻微但显著降低CHO-K1细胞DNA片断化水平,2.0 mT或3.0 mT的50 Hz磁场暴露均未显著影响CHO/dhfr-细胞DNA片断化水平。

2)2.0 mT或3.0 mT的50 Hz磁场暴露均未引起CHO-K1细胞活力的显著变化,2.0 mT(p<0.05)非3.0 mT的50 Hz磁场暴露显著提高CHO/dhfr细胞活力；2.0 mT或3.0 mT的50 Hz磁场暴露未显著影响CHO-K1细胞增殖能力,3.0 mT(p<0.05)非2.0 mT的50 Hz磁场暴露显著促进CHO/dhfr-细胞增殖；2.0 mT或3.0 mT的50 Hz磁场暴露对CHO-K1和CHO/dhfr-细胞周期分布均无显著影响。

3)2.0 mT的50 Hz磁场暴露未能显著影响50μM双氧水处理诱导的CHO-K1或CHO/dhfr-细胞yH2AX焦点形成；2.0mT的50 Hz磁场暴露显著降低了50μM双氧水处理诱导的CHO-K1细胞DNA片段化(p<0.05),但未显著影响50μM双氧水处理诱导CHO/dhfr-细胞DNA片段化水平改变。

根据以上研究结果,在一定实验条件下,1)50 Hz磁场未影响GC-1spg和GC-2 spd细胞遗传毒性；50 Hz磁场提高GC-1 spg细胞活力；50 Hz磁场促进双氧水处理诱导的GC-2 spd细胞yH2AX焦点形成。2)50 Hz磁场降低CHO-K1细胞DNA片断化水平、抑制双氧水处理诱导的CHO-K1细胞DNA片段化；50 Hz磁场提高CHO/dhfr-细胞活力、促进细胞增殖。

参考文献

[1]The relationship between residential proximity to extremely low frequency power transmission lines and adverse birth outcomes.Auger Nathalie,Joseph Dominique,Goneau Marc,Daniel Mark.Journal of Epilepsy.2010

[2]Endogenous DNA damage as related to cancer and aging.Ames B N.Mutation Research.1989

[3]Fifty hertz magnetic fields individually affect chromatin conformation in human lymphocytes:dependence on amplitude,temperature,and initial chromatin state.Sarimov Ruslan,Alipov Eugene D,Belyaev Igor Y.Bioelectromagnetics.2011

[4]Superimposition of an incoherent magnetic field eliminated the inhibition of hormone secretion induced by a 50-Hz magnetic field in human villous trophoblasts in vitro.Sun Wenjun,Tan Qiu,Pan Yongmiao,Fu Yiti,Zhang Dan,Lu Deqiang,Chiang Huai.Cellular physiology and biochemistry:international journal of experimental cellular physiology,biochemistry,and pharmacology.2010

[5]DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.Rogakou E P,Pilch D R,Orr A H,Ivanova V S,Bonner W M.Journal of Biological Chemistry.1998

[6]A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.Singh N P,McCoy M T,Tice R R,Schneider E L.Experimental Cell Research.1988

[7]Reproductive hazards among workers at high voltage substations.Nordstr?m S,Birke E,Gustavsson L.Bioelectromagnetics.1983

[8]魏晓霞.50Hz磁场暴露对生殖系统细胞DNA损伤的影响[D].浙江大学,2016.