粘菌素的检测

背景及概述^[1][2]

多粘菌素是从多粘杆菌培养液中分离出的一种多肽类抗生素。由于不同菌株产生化学结构不全相同的多粘菌素A、B、C、D、E。临床应用上市的产品主要是多黏菌素B和多黏菌素E (又称黏菌素，colistin)的硫酸盐和甲磺酸盐。多黏菌素B和E的抗菌谱相似，但抗菌活性有所不同。一般多粘菌素B的作用优于多粘菌素E。多粘菌素于20世纪50年代被开发出来，20世纪60年代用于治疗革兰阴性菌感染，特别是铜绿假单胞菌所致感染。

由于其抗菌谱窄，肾毒性较明显，特别是20世纪80年代后一些新的广谱抗菌药物如第三代头孢菌素、碳青霉烯类等药物的出现和在临床的广泛使用，导致多黏菌素被弃用。多黏菌素E(黏菌素)(colistin)是一个由多种组份组成的多肽类抗生素，主要由E₁和E₂组成(或称为A或B)。在20世纪50年代，多黏菌素E(黏菌素)就应用于临床，主要用于革兰氏阴性菌引起的感染，特别是由多重耐药绿脓杆菌(P.aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)等引起感染的治疗。

临床使用的多黏菌素E(黏菌素)有两种，一种是口服或局部使用的硫酸多黏菌素E(黏菌素)(也称硫酸黏菌素)，另一种是供注射用的多黏菌素E(黏菌素)甲磺酸钠(ColistimethateSodium)。这两种药物都是多组份药物，在硫酸多黏菌素E(黏菌素)中，含有包括E₁、E₂、E₃等至少5种组份(参见欧洲药典5.0)，同样在多黏菌素E(黏菌素)甲磺酸钠也至少含有多黏菌素E(黏菌素)₁甲磺酸钠和多黏菌素E(黏菌素)₂甲磺酸钠等5种组份。

自上世纪80年代开始因高发的肾脏毒性和神经毒性，多黏菌素E(黏菌素)(colistin)的应用受到限制，并几乎被临床弃用。但是近年来，由于革兰氏阴性菌耐药株尤其是多耐药菌株感染病例的出现以及新药开发有限的情况下多黏菌素E(黏菌素)(colistin)再次引起了全球医疗界的重视。同样如何提高多黏菌素E(黏菌素)(colistin)的抗菌活性、降低其毒性从而扩大临床适用人群也成为了药学研究者所面临的技术难点。

制备^[2]

泡沫分离提取多粘菌素E。十二烷基硫酸钠可以用于多粘菌素E的泡沫分离。实验确定的操作条件为：pH4～5，气速220mL/min，SDS浓度0.06g/L，此条件下提取率达到80%，富集比达到4.2。微生物实验证明，SDS不影响多粘菌素E的抗菌活性，因此本方法是可行的。泡沫液中的SDS通过正丁醇进行萃取回收，盐析剂的存在可大大提高萃取回收率。有机相/水相为1∶12.5，在0.5mol/LNaCl存在的情况下，SDS脱除率达到99.4%，实现了泡沫分离后多粘菌素E的纯化。泡沫分离法能够有效地提取多粘菌素E，克服了离子交换法污染严重等问题，因此具有很好的应用前景。

药理作用^[3]

本品主要作用于细菌细胞膜，使细胞内的重要物质外漏；其次影响核质和核糖体的功能，为慢效杀菌剂。大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属对本品敏感，本品对铜绿假单胞菌的抗菌活性差异较大。不动杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、流感嗜血杆菌、百日咳鲍特菌、嗜肺军团菌通常敏感。霍乱弧菌可呈现敏感，但埃尔托型弧菌耐药。沙雷菌属、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、变形杆菌属、布鲁菌属均耐药。脆弱拟杆菌耐药，而其他拟杆菌属和真杆菌属则很敏感。所有革兰阳性菌对本品均耐药，本品属窄谱抗生素。

适应证^[3]

肠道手术前准备或用于大肠杆菌性肠炎和对其他药物耐药的菌痢。

剂量与用法^[3]

口服，成人每日100万～300万单位，分3次服。儿童每次25万～50万单位，每日3～4次。宜空腹给药。静脉滴注与肌内注射，每日100万～150万单位。

注意事项^[3]

对本品过敏者禁用。严重肾功能损害者及孕妇慎用。不宜与其他肾毒性药物合用。使用本品可能出现恶心、呕吐等胃肠道反应及皮疹、瘙痒等过敏反应。

检测方法^[4]

1. HPLC法

反相高效液相色谱法测定硫酸多粘菌素E脂质体的含量及包封率，色谱柱为DiamonsilC8柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相均采用0.01mol·L－1三氟乙酸-乙腈系统，流速为1.0mL·min－1，采用的紫外检测波长分别为215nm和205nm。多粘菌素E1在50～300μg·mL－1范围内线性良好。由于多粘菌素E的紫外吸收很弱，且为末端吸收，故对流动相及检测器的要求较高，常用的甲醇流动相系统无法用于该物质的测定，并且要求所使用的紫外检测器灵敏度要比较高，否则难以得到良好的响应。

使用具蒸发光散射检测器同时测定配方中妥布霉素和硫酸多粘菌素E的含量。色谱柱是ZorbaxSBC18柱(150mm×4mm，3.5μm)，采用乙腈-三氟乙酸流动相系统进行梯度洗脱。重复性测定结果表明相对标准偏差低于3.0%，线性范围在0.16～0.24mg·mL－1。该法具有良好的专属性、准确度、精密度和线性。在药物分析中，对于没有发色基团的药物成分的测定，蒸发光散射检测器是一个比较好的选择。

2. LC-MS/MS法

固相萃取预处理技术相关文献报道表明，LCMS/MS法很好地应用于检测培养液、牛奶、血液、尿液及其他生物样品中的多粘菌素E。在样品处理中，均采用了固相萃取(SPE)技术对待测样品进行预处理，采用电喷雾离子源(ESI)，正离子检测方式。多粘菌素E主要成分多粘菌素E1，E2在培养液中的线性范围为0.48μg·mL－1～9.60μg·mL－1；在人血浆中为0.028μg·mL－1～1.78μg·mL－1，0.016μg·mL－1～1.01μg·mL－1。

培养液中的多粘菌素E的定量下限为0.48μg·mL－1；牛奶中多粘菌素E1的定量限为50μg·kg－1；而人血浆中硫酸多粘菌素E1的定量下限为0.028μg·mL－1，硫酸多粘菌素E2则可低至0.016μg·mL－1。固相萃取技术用于除去待测样品中的内源性杂质，提取多粘菌素E1和E2，不需要经过衍生化，使样品的前处理简单快速，所需样品体积少，处理干净，分析时间短，能有效保护质谱仪，对于多粘菌E素临床前及人体药代动力学的研究及食品中的残留是比较理想的。

3. UPLC-MS/MS法

超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法分析动物源性食品中及水产品中残留的多粘菌素E。多粘菌素E1，E2的线性范围是200ng·mL－1～2000ng·mL－1，检出限分别为10.0μg·kg－1和15μg·kg－1，定量下限为40.0μg·kg－1和50μg·kg－1。与液相色谱法、超高效液相色谱法相比较，该法每个样品的分析时间非常短，仅需5min，这对于残留分析是一个很有吸引力的过程，它还满足在鱼类中多粘菌素E的最低执法限度所需的灵敏度的要求(200μg·kg－1)，且没有来自母体的干扰，在动物源性食品及水产品中测定多粘菌素E1、E2的的残留是十分有用的。

4. MECC法

采用胶束电动毛细管色谱法(MECC)对硫酸多粘菌素E药物中的主要成分多粘菌素E1和E2进行了分离和测定。分别考察了电泳电压、表面活性剂种类、Brij-35(月桂醇聚氧乙烯醚)浓度、乙腈含量、磷酸盐缓冲液的pH值、氯化钠浓度等实验参数对实验结果的影响。从而确定了的分离条件：电泳电压为10kV，运行缓冲液为含有30mmol·L－1Brij-35、5%(体积分数)乙腈、0.167mol·L－1氯化钠的磷酸二氢钠缓冲液(0.01mol·L－1，pH4.1)。在优化的实验条件下，E1和E2得到了较好的分离，分离度达到1.94。以多粘菌素E1为例，柱效和峰面积的日间及日内测定的相对标准偏差(ＲSD)均小于5%。

主要参考资料

[1] CN201110032464.7多黏菌素E(黏菌素)组合物及其制备方法和用途

[2] 泡沫分离提取多粘菌素E的工艺研究

[3] 医师案头用药参考

[4] 多粘菌素E检测方法的研究新进展