无菌脱纤维羊全血

背景^[1-6]

无菌脱纤维羊全血是对健康绵羊无菌采血，玻璃珠摇床脱纤维而成，天然新鲜血液，颜色鲜红，无任何细菌、真菌、支原体、衣原体，不添加任何防腐剂、抗生素。鉴别方式：血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出，放入试管中，不加抗凝剂，则凝血反应被激活，血液迅速凝固，形成胶冻。凝血收缩，其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清，也可于凝血后经离心取得。

在凝血过程中，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，所以血清中无纤维蛋白原，这一点是与血浆的区别。而在凝血反应中，血小板释放出许多物质，各凝血因子也都发生了变化。这些成分都留在血清中并继续发生变化，如凝血酶原变成凝血酶，并随血清存放时间逐渐减少以至消失。这些也都是与血浆区别之处。但大量未参加凝血反应的物质则与血浆基本相同。为避免抗凝剂的干扰，血液中许多化学成分的分析，都以血清为样品。

无菌脱纤维羊全血可用于血平板培养基的配置，血平板培养基，通用名称是血琼脂平板培养基，用于链球菌、金黄色葡萄球菌及其他苛氧菌的分离、培养及溶血活性的检测。

常用血平板培养基：

1、哥伦比亚血琼脂+5%绵羊血（Columbia agar+5%sheep blood）

用途：用于分离难养细菌（fastidious bacteria）并鉴定溶血特性

简介：哥伦比亚培养基是专为营养要求苛刻的微生物而设计的分离培养基，添加羊血后，其丰富的营养可以供绝大多数的具有不同代谢类型的微生物生长。

2、哥伦比亚CNA琼脂+5%绵羊血（Columbia CNA agar+5%sheep blood）

用途：用于分离难养细菌并鉴定溶血特性的选择性培养基

简介：哥伦比亚CNA琼脂用于选择性培养临床样本中遇到的绝大多数革兰氏阳性细菌，培养基中所包含的萘啶酸（nalidixic acid）和柯利霉素（colimycin）将抑制绝大多数的革兰氏阴性菌和芽孢杆菌的生长。

应用^[7][8]

适应于血琼脂平板等培养基的生产、绵羊红细胞提取、细菌培养、生物医学研究基础等。

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae)是引起中耳炎、鼻窦炎、支气管炎以及社区获得性肺炎的重要病原体,是引起人类死亡的重要原因之一。抗生素被广泛运用于治疗此类感染,然而随着抗生素的运用,耐药性日趋严重,如此对耐药机制的研究显得尤为重要。但目前对耐药机制的研究主要是通过临床分离耐药株与标准敏感菌株之间的对比来进行探讨,对于S.pneumoniae能否通过体外诱导耐药,通过诱导耐药株与原始菌株之间的对比探讨耐药机制的研究尚未发现。

本课题通过琼脂稀释法测定MIC值获得对红霉素敏感的S.pneumoniae标准菌株和临床分离株;将S.pneumoniae接种于含红霉素的血琼脂平板上进行耐药性诱导,红霉素浓度由0.5MIC逐倍递增,直至敏感株变为耐药株,测定耐药株MIC值;将获得的耐药子代在无红霉素血琼脂平板上连续传代20次后,测定其MIC值,以检测其获得耐药的稳定性;对比分析诱导耐药前后S.pneumoniae生理生化学性质的变化;小鼠毒力试验检测诱导耐药前后试验菌株毒力的改变。

PCR与RT-PCR对诱导耐药前后受试菌株rplD、rplV基因以及23S rRNA扩增并测序;CPHmodels-2.0蛋白质空间构象预测系统对诱导耐药前后受试菌株rplD、rplV基因编码的核糖体蛋白L4和L22进行空间构象预测分析,并运用PyMOL蛋白质分析软件对其表面空间构象进行分析。通过试验筛选获得的试验菌株MIC值均为0.0312mg/L;诱导后标准菌株tigr4 MIC值增加到256mg/L,临床分离株C1和C2 MIC值均增加到32mg/L,标准菌株R6 MIC值未发生变化;耐药子代在连续传代20次后,其MIC值未发生改变。

经培养发现诱导耐药前后S.pneumoniae菌落特征、镜下形态以及对Optochin敏感性未发生改变;小鼠毒力试验结果显示诱导耐药前后S.pneumoniae毒力未发现明显改变(P>0.05);诱导耐药前后测序结果对比显示标准菌株tigr4核糖体蛋白L4发生V32A变异,L22发生D35G变异;而临床分离敏感株核糖体蛋白L4发生Q67R、K68E变异;空间构象分析核糖体蛋白L22的D35G及核糖体蛋白L4的Q67R、K68E变异导致其相应的表面空间构象发生明显改变。

综上所述,S.pneumoniae可通过红霉素体外诱导而导致耐药,并且该获得性耐药稳定性较好;诱导耐药前后S.pneumoniae生理生化学性质及毒力未发生明显改变;红霉素结合域发生新的变异是S.pneumoniae耐大环内酯类抗生素机制之一。

参考文献

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[4]Molecular characterisation of Hungarian macrolide-resistant Streptococcus pneumoniae isolates,including three highly resistant strain with the mef gene.Orsolya D,Ferenc R,Sebastian G.B.A.Internationgal Journal of Antimicrobial Agents.2005

[5]Emergence and epidemiology of fluoroquinolone-resistant Streptococcus pneumoniae strains from Italy:report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program(2001-2004).Lalitagauri M.D,,Helio S.S,,Eugenio D,et al.Diagnostic Microbiology and Infectious Disease.2006

[6]Antimicrobial resistance among Streptococcus pneumoniae in the United States:have we begun to turn the corner on resistance to certain antimicrobial classes.Doern GV,Richter SS,Miller A,et al.Clinical Infectious Diseases.2005

[7]Antimicrobial susceptibility profiles among common respiratory tract pathogens:a GLOBAL perspective.Sahm DF,Brown NP,Thornsberry C et al.Postgraduate Medicine.2008

[8]王强.红霉素体外诱导肺炎链球菌耐药的研究[D].重庆医科大学,2009.