小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠抑瘤素M(OSM)水平。用纯化的小鼠抑瘤素M(OSM)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入抑瘤素M(OSM)，再与HRP标记的抑瘤素M(OSM)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的抑瘤素M(OSM)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠抑瘤素M(OSM)浓度。

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒检测前准备工作：

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温，轻摇均匀，待结晶完全溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃

3.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒样本处理及要求：

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒操作步骤：

1．从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2．设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

3．样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4．除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5．弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7．每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒实验结果计算：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒可以用于重组人OSM的制备及诱导肝癌细胞分化的实验研究

抑瘤素M(OSM)能够诱导多种肿瘤细胞,如神经胶质瘤、骨肉瘤、乳腺癌、肺腺癌、白血病细胞发生形态和/或功能上的分化成熟。OSM对胚胎及成体肝脏均具有独特的生物学作用。鉴于此,本研究围绕OSM对肝癌细胞的诱导分化作用进行了如下工作。利用基因重组技术构建了毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母X-33,筛选出能够稳定高效分泌表达重组人OSM(rhOSM)的工程菌。经SDS-PAGE、Western Blot、N-末端15个氨基酸残基序列分析、AKTA explorer多功能纯化系统纯化、质谱测定其相对分子质量及体外活性检测,证明应用毕赤酵母表达系统分泌表达的rhOSM与天然OSM具有相同的理化性质和生物学活性。利用80 L发酵罐进行rhOSM中试规模发酵,并对其发酵条件进行优化,rhOSM表达量达到280 mg·L-1。同时建立了一种分离纯化rhOSM的新方法。利用光镜、透射电镜、MTT、RT-PCR、小鼠抑瘤素M(OSM)Elisa试剂盒、免疫荧光、免疫细胞化学染色、流式细胞术等方法和技术,体外水平观察rhOSM对人肝癌细胞SMMC-7721生长的抑制作用、细胞形态、超微结构、信号传导分子、细胞周期和凋亡率的影响及诱导肝癌细胞分化的相关生化指标的检测。结果表明rhOSM能够抑制SMMC-7721细胞生长、诱导其分化、促进其凋亡。通过观察rhOSM对BALB/c小鼠肝癌细胞H22皮下移植瘤生长的抑制情况、外周血中AFP水平、瘤组织病理学改变,表明rhOSM对小鼠肝癌细胞具有抑制生长、促进分化的作用。实验结果同时表明,短期腹腔注射rhOSM对小鼠肝脏、脾脏没有造成损伤,但对小鼠胸腺组织具有抑制作用。

参考文献

[1]Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria cells[J]..Bone,2009(5)

[2]Diagnosing and monitoring hepatocellular carcinoma with alpha-fetoprotein:New aspects and applications[J].Evi N.Debruyne;;Joris R.Delanghe.Clinica Chimica Acta,2008(1)

[3]Prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma:A systematic review[J].Christopher D.Mann;;Christopher P.Neal;;Giuseppe Garcea;;Margaret M.Manson;;Ashley R.Dennison;;David P.Berry.European Journal of Cancer,2007(6)

[4]Oncostatin M Gene Therapy Attenuates Liver Damage Induced by Dimethylnitrosamine in Rats[J].Tetsuhiro Hamada;;Ayuko Sato;;Tadamichi Hirano;;Takashi Yamamoto;;Gakuhei Son;;Masayuki Onodera;;Ikuko Torii;;Takashi Nishigami;;Minoru Tanaka;;Atsushi Miyajima;;Shuhei Nishiguchi;;Jiro Fujimoto;;Tohru Tsujimura.The American Journal of Pathology,2007(3)

[5]孔宁.重组人OSM的制备及诱导肝癌细胞分化的实验研究[D].吉林大学,2009.