快速末端修复A尾添加模块

背景^[1-6]

快速末端修复A尾添加模块是针对Illumina^®高通量测序平台文库构建而专业设计的DNA末端修复/A尾添加模块，具有高效、快速、易实现自动化的优势。本产品兼容1 ng^-1μg片段化Input DNA，可在单管内实现片段化DNA的末端补平、5端磷酸化和3端加A尾反应，得到5末端含磷酸基团且3末端带有dA突出的DNA产物。该产物无需纯化，即可使用Hieff NGS^TM Fast-Pace DNA Ligation Module进行文库构建接头连接反应。

快速末端修复A尾添加模块与Hieff NGSTM Fast-Pace DNA Ligation Module，2×Hieff CanaceTM High-Fidelity PCR Master Mix共同用于DNA文库构建，通过Illumina^®高通量平台测序验证其有效性。本产品中提供的所有试剂组分均经过严格质检，最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。 快速末端修复A尾添加模块兼容500 pg-1μg片段化Input DNA，可在单管内实现片段化DNA的末端补平、5'端磷酸化和3'端加A尾反应，得到5'末端含磷酸基团且3'末端带有dA突出的DNA产物。

质量控制：

Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Enzyme

1.SDS-PAGE纯度：>95%。

2.核酸内切酶活性：50μL反应体系中加入10μL本酶和1μgφX174 RF I DNA，37°C孵育4小时。经琼脂糖凝胶电泳检测,RF II转化比率<10%。

3.磷酸酶活性：在磷酸酶活性检测缓冲液中加入10μL本酶和2.5 mM对硝基苯磷酸，37°C孵育4小时。经光谱测定法检测，405 nm处无对硝基苯阴离子特征吸收峰。

4.功能活性：在1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Enzyme中加入1μL本酶和0.5μg包含5和3突出末端的片段化DNA，25°C孵育20分钟。经毛细管电泳检测，末端修复、加dA尾并磷酸化的DNA比率>95%。

Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer

1.16小时孵育检测：50μL反应体系中包含1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer和1μg HindIII-λDNA，37°C孵育16小时。经琼脂糖凝胶电泳检测，条带无降解；50μL反应体系中包含1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer和1μg T3 DNA，37°C孵育16小时。经琼脂糖凝胶电泳检测，条带无降解。

2.核酸内切酶活性：50μL反应体系中包含1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer和1μgφX174 RF I DNA，37°C孵育4小时。经琼脂糖凝胶电泳检测，RF II转化比<10%。

3.RNase活性：在1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer中加入40 ng FAM-RNA，37°C孵育16小时。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，条带无降解。

4.磷酸酶活性：在磷酸酶活性检测缓冲液中加入1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer和2.5 mM对硝基苯磷酸，37°C下孵育4小时。经光谱测定法检测，405 nm处无对硝基苯阴离子特征吸收峰。

应用^[7][8]

快速末端修复A尾添加模块可用于NGS测序实验中的DNA文库构建：

对马凡综合征（Marfan syndrome,MFS）患者和晶状体脱位综合征（Ectopia lentis syndrome,ELS）患者的原纤维蛋白-1（fibrillin-1,FBN1）基因,转化生长因子受体1（Transforming Growth Factor Beta Receptor TypeⅠ,TGFBR1）和转化生长因子受体2（Transforming Growth Factor Beta Receptor TypeⅡ,TGFBR2）进行基因突变筛查,有利于明确相应患者的患病原因,并可为家系成员的症状前检测或下一代的产前筛查提供依据。

方法1.NGS和MLPA技术在MFS和ELS基因诊断中的应用提取22例MFS患者和1例ELS患者的基因组DNA,用第二代测序技术（Next generation sequencing,NGS）对FBN1、TGFBR1和TGFBR2进行突变筛查,然后用Sanger测序对突变位点进行验证,对NGS未发现突变的病人,再应用多重连接探针扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA）检测FBN1、TGFBR1和TGFBR2是否存在大片段缺失/重复突变,对这两种方法提示有基因组大片段突变的外显子进行PCR和DNA Sanger测序以证实突变。

2.一个FBN1纯合突变家系的分析提取该先证者和该家系成员外周血全基因组DNA,用NGS技术对先证者FBN1进行突变筛查,然后用Sanger测序对突变位点进行验证并对家系成员进行突变位点的Sanger测序。提取先证者主动脉组织的RNA,用RT-PCR扩增突变所在外显子,并进行Sanger测序。结果1.NGS和MLPA技术在MFS和ELS基因诊断中的应用在22例MFS和1例ELS患者（18号患者）中发现20种FBN1突变,其中20种突变中有13个是错义突变、3个是无义突变、2个剪接位点突变、1个移码突变、1个是大片段缺失突变。

参考文献

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[2]An FBN 1 Deep Intronic Mutation in a Familial Case of M arfan Syndrome:An Explanation for Genetically Unsolved Cases?[J].Elisabeth Gillis,Marlies Kempers,Simone Salemink,Janneke Timmermans,Emile C.Cheriex,Sebastiaan C.A.M.Bekkers,Erik Fransen,Christine E.M.De Die‐Smulders,Bart L.Loeys,Lut Van Laer.Human Mutation.2014(5)

[3]Homozygosity for a FBN1 missense mutation causes a severe Marfan syndrome phenotype[J].J Hogue,C Lee,A Jelin,MN Strecker,VA Cox,AM Slavotinek.Clin Genet.2013(4)

[4]Efficient detection of factor IX mutations by denaturing high-performance liquid chromatography in Taiwanese hemophilia B patients,and the identification of two novel mutations[J].Pei-Chin Lin,Yi-Ning Su,Yu-Mei Liao,Tai-Tsung Chang,Shih-Pien Tsai,Hsiu-Lan Shu,Shyh-Shin Chiou.Kaohsiung Journal of Medical Sciences.2013

[5]The clinical spectrum of missense mutations of the first aspartic acid of cbEGF‐like domains in fibrillin‐1 including a recessive family[J].Hum.Mutat..2010(12)

[6]Low frequency of MLL-partial tandem duplications in paediatric acute myeloid leukaemia using MLPA as a novel DNA screenings technique[J].Brian V.Balgobind,Iris H.I.M.Hollink,Dirk Reinhardt,Elisabeth R.van Wering,Siebold S.N.de Graaf,Andre Baruchel,Jan Stary,H.Berna Beverloo,Georgine E.de Greef,Rob Pieters,C.Michel Zwaan,Marry M.van den Heuvel-Eibrink.European Journal of Cancer.2010(10)

[7]An FBN1 pseudoexon mutation in a patient with Marfan syndrome:confirmation of cryptic mutations leading to disease[J].Dong-chuan Guo,Prateek Gupta,Van Tran-Fadulu,Tera V.Guidry,Magalie S.Leduc,Frederick V.Schaefer,Dianna M.Milewicz.Journal of Human Genetics.2008(11)

[8]卢鑫鑫.基于NGS、MLPA和Sanger测序的FBN1基因突变研究[D].福建医科大学,2016.