双链DNA（dsDNA）定量试剂

背景^[1-7]

双链DNA（dsDNA）定量试剂能特定检测双链DNA，是一种简单精确的定量方法。即使是样品中有RNA同时存在，该方法对双链DNA仍有极高的选择度，对比传统的DNA定量检测也具有稳定性高、线性范围宽和灵敏度高等优势。试剂盒包含浓缩的定量检测试剂、稀释缓冲液以及已稀释好的双链DNA标准品。您只需用试剂盒提供的缓冲液稀释定量检测试剂，加入待检测样品（体积1µl-50µl皆可），就可以通过荧光酶标仪或荧光仪读取荧光读数。

这项检测方法对常见的污染物如蛋白质、盐类、溶剂、去污剂或游离核苷酸都有很好的耐受性，也适用于在微孔反应板、离心管或比色皿中进行实验。双链DNA（dsDNA）定量试剂内含有Picogreen。

Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料，常用于双链DNA的定量检测。历来DNA浓度的测定在cDNA文库的构建，DNA亚克隆、PCR产物的估测等领域中具有重要意义。疫苗等生物制品中残留微量DNA的检测更是直接关系到人类的健康。

常用的检测核酸的方法有:1）紫外吸光法（A260），该法操作简便，但DNA样品中核苷酸、单链DNA、RNA和蛋白质对紫外吸收信号影响很大，还容易受到核酸样品中污染物的干扰，不能区分DNA和RNA，而且灵敏度低（ΔA260=0.1相当于5ug/ml的dsDNA）；2）探针杂交法，该法是传统检测微量DNA的常用方法，基本能满足目前疫苗和治疗性生物制品的检测需求，但是该法耗时较长，操作繁琐，稳定性、敏感性和特异性较差；3）Hoechst33258染料法，Hoechst33258是一种一定程度上特异于双链DNA的核酸染料，基本不受蛋白质的干扰，可以检测低至10ng/ml的DNA；在检测稳定性和灵敏度上仍达不到理想效果。

Picogreen dsDNA定量法：Picogreen仅在与DNA双链结合后才发出荧光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比，在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下，可以选择性地检测低至25pg/ml的dsDNA。该分析在三个数量级范围内呈线性，且几乎无序列依赖性，可以精确地测量多个来源的DNA，包括基因组DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR扩增产物。

相比传统的方法，Picogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下优势：①灵敏度高：数量级较UV吸光读数更敏感，可节省宝贵的样品；②特异性强：在等摩尔的RNA存在的条件下，对dsDNA具有特异性；③耐受性好：耐受较高浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白或琼脂糖，可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。④易于使用——只需在样品中加入染料，等待5分钟，然后读数即可，且适用于96和384孔板；与大多数基于荧光的酶标仪和荧光计兼容。⑤适用范围广：可适用于PCR的分析、芯片样品、DNA损伤分析、酶活性分析、基因组DNA定量以及复杂混合物中dsDNA的检测和病毒DNA定量等多种领域。

应用^[7][8]

双链DNA（dsDNA）定量试剂可用于快速检测双链DNA（dsDNA）的含量：

利用荧光染料PicoGreen能够嵌入适配体与互补序列形成的dsDNA,从而引起荧光强度改变的特性开发了一种简单的通用型非标记荧光法,可高灵敏度高特异性的检测无机离子、蛋白质及小分子。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选得到的一段具有识别作用的单链寡核苷酸片段,可为ssDNA和RNA。核酸适配体能够通过折叠形成特定的二级和三级结构与靶标高亲和力(μmol/L-pmol/L)高特异性结合。

利用适配体技术开发的检测方法包括比色法、荧光法、电化学法等多种方法。其中荧光法具有简单、快速、易于自动化的特点,其有效性已被广泛证实。目前已经利用适配体开发了众多的荧光检测方法,但是大部分的荧光法需要对适配体进行修饰,这些操作费时并且分析成本较高,甚至有可能因为适配体上修饰了荧光基团或者淬灭基团而影响适配体与靶标结合的特性,从而降低检测的灵敏度。

参考文献

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