克班宁的药理和检测

背景及概述^[1]

心律失常系临床常见疾病，轻者影响生活与工作质量，而恶性心律失常如室性心动过速、室颤、房颤等导致的心源性猝死是心血管疾病死亡的主要原因，我国心血管病的发生率已有年轻化和不断增长的趋势。目前用于临床预防和治疗心律失常的药物可分为四类：Ⅰ类：钠离子通道阻滞剂，分为ⅠA、ⅠB、ⅠC三个亚类。Ⅱ类为β肾上腺受体阻滞剂，如美托洛尔。Ⅲ类为钾通道阻滞剂，选择地延长复极过程的药，它们延长动作电位时程及心内膜下复苏比，如索托洛尔；Ⅳ类为钙拮抗剂，如维拉帕米等，多数抗心律失常药物具有一定的毒副作用。具有多通道阻滞（Ikr、Iks、Ito、INa等）作用的复合型抗心律失常药物，可明显降低毒作用，成为了目前研究热点。

克班宁（Crebanine，Cre）属于阿朴菲型生物碱，提取自防己科千金藤属植物云南地不容（StephaniayunnanensisLo.）块根中。分子式为C20H21NO4，分子量为339.38，属于异喹啉类阿朴菲类生物碱。易溶于硫酸、盐酸、乙醇、甲醇、氯仿，微溶于石油醚及乙醚中，不溶于水。研究表明克班宁具有较强抗心律失常的作用，对多种动物心律失常模型均显著对抗作用，是一种值得深入研究开发的先导化合物。克班宁抗心律失常的小鼠静注有效剂量为2.5～5mg/kg，LD50为9.382mg/kg。克班宁注射给药对氯化钡诱发大鼠心律失常实验，与NS组相比，恢复窦性心律的鼠数明显增加，恢复窦性心律所需的时间明显缩短。克班宁注射给药对乌头碱诱发大鼠心律失常实验，与NS组相比，能提高乌头碱所致大鼠室性心动过速，室性纤颤，心脏骤停。克班宁灌胃对氯化钡诱发大鼠心律失常实验，与NS组相比，恢复窦性心律的鼠数、能缩短恢复窦性心律所需的时间且维持窦性心律≥10min的鼠数，均有显著性意义。但研究同时发现克班宁静注抗心律失常治疗指数小，安全范围比较窄，剂量不当可能导致中毒或死亡，且经静注或灌胃给药的克班宁心律失常虽起效快，但持续时间较短、易出现反复等现象。将其制备成透皮给药贴剂可显著延长作用时间，降低其毒副作用。

种质资源^[2]

Cre是由防己科千金藤属(Stephania)植物“山乌龟”的部分品种中提取而得。早期研究发现Cre分布于千金藤属的5种植物中：金线吊乌龟 (又称白药子、头花千金藤)S.cepharantha；血散薯 (又称黔桂千金藤)S.dielsiana；小叶地不容S.succifera；台湾千金藤S.sasakii；S.venosa。并指出千金藤属植物中所含的生物碱，在植物体中，因器官不同也有十分明显的差异。如Cre在S.cepharantha的种子、S.venosa的叶片、S.dielsiana的块根中含量较高。其中S.dielsiana的块根中含Cre0.3%。后又有研究发现Cre存在于药用地不容S.offcinarum；白线薯S.brachyandra；齿叶地不容 (又称齿叶千金藤)S.dentifolia；海南地不容S.hainanensis及云南地不容S.yunnanensis5种植物中。后据文献报道用高效液相色谱法检测，有许多种山乌龟均含Cre，只是每个种间Cre含量差异较大，即便是同一种，也因其所生长的环境、产地不同，Cre的含量也不尽相同。其中共有14种山乌龟被检出含Cre：粪箕笃S.longa；金线吊乌龟S.cepharantha；齿叶地不容S.dentifolia；地不容S.epigaea；血散薯S.dielsiana；大叶地不容S.dolichopoda；S.excentrica；海南地不容S.hainanensis；桂南地不容S.kuinanensis；临沧地不容S.lincangensis；长柄地不容S.longipes；小叶地不容S.succifera；黄叶地不容S.viridiflavens；云南地不容S.yunnanensis。且发现S.dentifolia、S.dielsiana、S.kuinanensis、S.longipes、S.succifera及S.yunnanensis6种山乌龟中Cre含量较多。上含Cre的山乌龟多分布于东经18～35°北纬97～120°之间，长江流域及南部各省区，尤以云南、广西为多。

主要理化性质^[2]

分子式为：C20H21NO4，分子量为339.38。Cre在不同的溶剂中所成的晶型不同，不同的检测条件下测得的有关数据亦有差别。综合有关文献，Cre的有关性质如下：

结晶状态：Cre可呈微黄色针晶(醇-石油醚)、白色针晶(石油醚-乙醚)、白色柱状晶体(无水乙醇)、针晶(乙醚)、淡黄色针晶(甲醇)、白色块状结晶(甲醇)、微黄色针晶(石油醚)等。其盐酸盐为黄色结晶。

溶解性：Cre易溶于硫酸、盐酸、乙醇、甲醇、氯仿，微溶于石油醚及乙醚中，不溶于水，其盐酸盐易溶于水，pH7.4。

其他性质：mp115～118℃，[α]D23-65.29(C=0.29，EtOH)；UVλEtOHmaxnm(logε)：218(4.5)，280(4.3)，320(sh，3.6)。IRVKBrmaxcm-1：1600，1500(芳环)，1280，1220，1030(醚链)，928(二氧次甲基)，805(二邻芳氢)。′H-NMR(CDCl3)δ：2.7(3H，S，N-CH3)，3.83(3H，S，OCH3)，3.92(3H，S，OCH3)，5.92(1Hd，J=1.5H2，-OHCHO-)，6.05(1H，d，J=1.5H2，-OHCHO-)，6.5(1H，s，C3-H)，6.85(1H，d，J=8H2，C10-H)，7.80(1H，d，J=8H2，C11-H)。MSme：339(M+)，338(M-1，100%)。

药理^[2-3]

实验表明，Cre具多种药理作用：腹腔注射Cre能明显减少小鼠自发活动次数(镇静作用)：对戊巴比妥钠的催眠作用呈现协同，且可对抗可拉明所致的脑干型惊厥(增强中枢抑制药的作用)：腹腔注射Cre对电及化学刺激引起小鼠疼痛有明显镇痛作用，且电刺激法显示Cr的镇痛作用弱于吗啡强于颅痛定，化学刺激法显示Cre镇痛作用治疗指数>6，Cre对兔离体子宫、肠肌有解痉作用；对GLC和HeLa细胞的体外杀伤实验表明，Cre有一定的体外抗肿瘤活性。Cre可对抗BaCl2引起的大鼠心律失常，且维持窦律时间较Lid长；还可对抗AC引起的大鼠心律失常，对Oua引起的豚鼠心律失常作用不大明显，Cre还可对抗CaCl2引起的大鼠心律失常，对抗氯仿引起的小鼠室颤；拮抗组织胺所致豚鼠胆囊的收缩、拮抗高K+离子引起的豚鼠胆道口括约肌的收缩；能明显增加K562HHT细胞内DNR浓度，调节多药耐药性等。　

检测^[2]

1. 定性检查

除生物碱所应具有的特有反应外，Cre可用TLC检查其存在与否。色谱板：硅胶GCMC-Na板，其中CMC-Na为0.5%～1%，110℃活化30min备用。对照品溶液及供试品溶液可视情况而配。显色剂：改良碘化铋钾溶液。展开晾干后也可以在365nm或254nm下观察，均应呈紫色荧光。展开剂：经大量实验，我们发现用苯-氯仿-甲醇(7∶1∶2)或氯仿-甲醇(15∶1)展开，其斑点圆整，展开效果较好，杂质干扰小。

2. 定量测定

可采用RP-HPLC法测定Cre的含量。

色谱条件　色谱柱：LidrosorbRP-C18(5μm)150mmX4.6mm，流动相以A和B作梯度洗脱，A为甲醇-水-10%三乙胺(甲醇液)(50∶50∶0.5)，B为甲醇-三乙胺(甲醇液)(100∶0.5)；起始流动相为5%B，线性递增至8min为15%B，至28min为75%B，28min后维持75%B4min，再返回至起始流动相，流速：1.0mlmin.检测波长282nm.灵敏度0.02AUFS.室温18～25℃。

样品处理：样品粉末约120mg精密加入甲醇5.0ml，超声30min(280mA)，浸泡23h，再超声10min，放置50min，取出上清液，经微孔滤膜(0.45μmF膜)过滤后进行HPLC分析。还可用HPLC作Cre的定量分析。分析条件：ZorbaxCN柱，MeOH∶H2O∶NH40H(85∶15∶0.2)为流动相，流速0.3mlmin，波长282nm，灵敏度0.08Aufs，纸速2.0mm。样品的测定：精密称取待测生物碱样品4mg，溶于2ml容量瓶内，甲醇定容，每次进样5～10ul，每进样3次即注入一次标准样品对照，测定Cre的峰面积值，与标准品数据对照，做数据处理。

提取分离^[2]

已知的提取分离方法如下：

1. 渗漉法

黔桂千金藤(S.dielsianaWu)块根粗粉用80%乙醇渗漉，乙醇提取物用2%盐酸捏溶，过滤，滤液用碱调至pH9，静置，吸滤，滤液用氯仿萃取，得酚性生物碱部分；滤渣溶于酸水，用氯仿萃取，得非酚性生物碱部分(盐酸捏溶所得滤液用氯仿直接萃取亦可得该部分)。非酚性生物碱部分浓缩后析出的粗品，用乙醚-丙酮分步结晶，得千金藤碱(Stephanine)及克列班宁(Crebaine)。取海南地不容(S.hainanensisH.S.LoetY.Tsoong)块根粉末，用95%乙醇冷浸渗漉，渗漉液减压浓缩得棕色浸膏物，加4%酒石酸水溶液捏溶，过滤去不溶物，得澄清液。再用浓氨水碱化，析出大量沉淀。用乙醚提取至醚层生物碱呈微弱反应，合并，干燥，浓缩至干。加适量无水乙醇溶解放置，析出克班宁。

2. 渗漉加树脂交换加柱层析法

小叶地不容(S.succiferaH.S.LoetY.Tsoong)根粉用0.2%盐酸渗漉，渗漉液通过磺酸型阳离子交换树脂，树脂用氨水碱化后用乙醚，氯仿和乙醇顺序洗脱。乙醚洗脱部分浓缩后析出结晶，母液蒸干得到浸膏。取乙醚母液浸膏，用硅胶进行柱层析，用氯仿、1%甲醇-氯仿及甲醇顺序洗脱，第22～29份(氯仿洗脱)浸膏，用乙醚结晶，得克班宁针晶。

3.溶剂法

齿叶千金藤(S.dentifoliaLoetYang)块根切片，40～50℃干燥，捣碎，用95%乙醇回流0.5～1h，滤过，残渣继续用95%乙醇回流2次，滤过，合并滤液，回收乙醇，残渣加2%(gml)硫酸溶解，滤过，滤液加10%氢氧化钠液调至pH12，滤过，滤液保存，残渣用醇、石油醚等反复结晶，得微黄色针结晶，是为克班宁。取云南地不容(S.yunnanensisH.S.Lo)生药切片，用2%H2SO4提取，浸液再用饱和NaOH调pH8～9，过滤，沉淀烘干，用10%盐酸溶解，氯仿萃取，回收氯仿后以水热溶过滤，滤液以氨水碱化，沉淀过滤，干燥，石油醚重结晶得Cre。

4. 溶剂加柱层析法

白线薯(S.brachyandraDiels)块根干燥粗粉加甲醇回流提取4次，每次3h，过滤，滤液减压回收甲醇，残留物加5%盐酸液，超声波振溶，过滤，滤液用氯仿反复萃取，合并氯仿液，回收氯仿，得残留物A。A部分用硅胶柱层析(CHCl3- MeOH=10∶1)，分得AⅠ和AⅡ两部分。AⅠ再经硅胶柱分(C6H6-EtOAc- MeOH =14∶5∶1)，得Ⅱ和Ⅳ。Ⅱ经甲醇结晶得淡黄色针晶，是为Cre。取小叶地不容(S.succiferaH.S.LoetTsoong)块根的粉末用95%乙醇热回流提取3次，每次2h，合并醇提取液，减压浓缩得浸膏状物，加4%酒石酸水液捏溶，过滤，得澄清酸液，再用浓氨水碱化至pH7，即有大量沉淀析出，用乙醚提取至生物碱反应弱时，合并乙醚液，蒸干，得固体物，该固体物再经硅胶多次柱层析分得Cre。取药用地不容(S.officinarumLoetYang)块根粉末，用95%乙醇热回流提取，醇浸膏用4%酒石酸捏溶、过滤，酸液放置，过滤除去析出物，澄清酸液用氨水碱化，用乙醚提取，浓缩，加乙醇放置析出异紫堇定碱及1-四氢巴马汀的混合物经硅胶层析用二氯甲烷递增甲醇溶剂系统洗脱，两者得到很好的分离。二氯甲烷提取液浓缩放析出异紫堇定碱，母液经硅胶层析，用乙酸乙酯递增甲醇溶剂系统洗脱，即可得到Cre。

主要参考资料

[1] CN201710170894.2一种克班宁透皮贴剂及其制备方法

[2] 克班宁的研究进展

克班宁的抗心律失常作用