PiRNA定量PCR检测

背景^[1-6]

PiRNA定量PCR检测可以对piRNA的总体表达情况进行检测。三个物种的piRNA序列都来自NCBI数据库，并且使用UCSC Blat技术在HG19,MM9和RN4数据库中分别进行染色体定位（map）。我们采用恰当的策略来挑选探针，然后使用双重方法（duplex method）设计60 mer的反义寡核苷酸探针。

piRNA（Piwi-interacting RNA）是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类非编码小RNA。成熟的piRNA是一类长约26-32nt的单链小RNA分子。在小鼠睾丸内只存在几百种不同的miRNA，而piRNA却至少有5万种。piRNA即使在近缘物种之间保守性也很差，在长度、表达类型和基因结构上则与microRNA截然不同。

piRNA是一类长度为26～31nt单链的小RNA，大部分集中在29～30nt。piRNA的表达具有组织特异性，只存在于具有全能性的动物细胞，如生殖细胞、肿瘤细胞和干细胞等。piRNA通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复合物（piRC）来发挥生物学功能（沉默转录基因过程，维持生殖系和干细胞功能，调节翻译和mRNA的稳定性）。此外，piRNA在一些癌症细胞中存在异常表达的现象，提示piRNA可能参与癌症的发生，并可作为癌症诊断和治疗中的潜在生物标记物。

PiRNA的沉默机制主要利用（1）通过转录自与转座元件（TE）加工而成piRNA，并结合互补结合TE抑制其转录；（2）通过编码蛋白基因区转录加工成piRNA,与AGO3，AUB蛋白形成复合体抑制靶基因；（3）由基因3'UTR转录生成piRNA，并结合与PIWI,抑制靶基因；（4）从piRNA簇生成piRNA，并与AUB等蛋白相互作用起到抑制靶基因的目的。（5）另外，piRNA也被报道有起到高甲基化调控的协同调控行为。

piRNA的生成加工过程途径（Biogenesis Pathway）主要分为二大类：（a）转录自TE转录元件或piRNA簇的反义链经过加工，加载到蛋白AUB或PIWI上形成功能piRNA。通常piRNA介导的piRISC复合体起到引发第二种生成加工途径的激发作用。（b）通过AUB和AGO3蛋白的剪接体翠功能发生piRNA扩增效应（即Pingpong循环反应）。

应用^[7][8]

PiRNA定量PCR检测可用于PiRNA沉默转录基因过程；维持生殖系和干细胞功能的研究：

piRNA通路是近年来在多种动物生殖细胞中发现的小RNA通路,在配子生成、转座子抑制及维护基因组的完整性方面发挥着重要的作用。基因组中的转座现象可能会导致重要基因功能的缺失,在生殖细胞中,转座子的频繁活动会导致生殖细胞的凋亡,影响遗传信息的传递,从而威胁物种的生存和繁衍。硬骨鱼中转座子的种类远远超过哺乳动物,其在基因组中的周转频率也更高。

piRNA通路基因作为在生殖系统中抵抗转座侵扰、保护基因组的卫士,必然受到强大的选择压力。大部分硬骨鱼都是通过体外受精进行繁殖,生殖细胞通过持续的有丝分裂和减数分裂形成更多生殖细胞,piRNA通路基因必须应对转座带来的持续威胁。因此,推测硬骨鱼中piRNA通路基因和转座子存在共进化。调取了21个哺乳动物和8个硬骨鱼的18个基因的编码区序列,这些基因包括miRNA/siRNA通路基因(Ago家族)和piRNA通路基因。

此外,克隆了黄鳝Ago家族及piRNA通路的9个基因。通过谱系间的选择压力分析,以miRNA/siRNA通路基因和β-actin作为对照,发现piRNA通路基因在硬骨鱼中加速进化,同时在这些基因的功能域检测到了大量的正向选择位点。发现了piRNA通路基因在黄鳝中的进化比其它硬骨鱼更快,表达谱分析显示这些基因在黄鳝三种性腺中高表达,为进化分析提供了佐证。

1.黄鳝Ago家族基因和piRNA通路基因的克隆通过设计兼并引物和RACE技术,克隆了黄鳝Ago家族及piRNA通路的9个基因,包括Ago1、Ago2、Ago3a、Ago3b、Ago4、Piwill、Piwil2、Tdrdl及Prmt5。Ago基因是miRNA/siRNA通路的核心蛋白,在进化分析中作为对照基因。通过序列比对和构建系统发育树证实了克隆的黄鳝基因确实是该通路的基因。2.黄鳝Ago家族基因和piRNA通路基因的表达分析通过RT-PCR及实时定量PCR分析显示,Ago家族基因在黄鳝组织中广谱表达,piRNA通路基因则主要在性腺中表达。

在黄鳝三种性腺中,piRNA通路基因的表达远高于Ago家族基因,提示它们在黄鳝配子生成和性腺分化中具有重要功能。构建的Ago家族基因和Piwi家族基因的荧光表达载体转染细胞,发现这些基因主要在细胞质表达。piRNA通路基因在性腺中的高水平表达说明了其重要作用,从而为进化分析得出的结论提供了佐证。

参考文献

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