纳豆激酶的应用

背景及概述^[1]

纳豆(Natto)是日本的一种传统的发酵豆制品，由纳豆菌(Bacillusnatto)在一定温度、湿度下发酵蒸煮大豆而成，作为日本人的主要佐餐食品已有两千多年的历史，在民间一直药食兼用。成熟的纳豆色泽金黄，表面覆有一层黏性物质，挑起时有长长的拉丝状物质。纳豆风味独特，营养丰富，具有多种保健功能，被誉为“超级健康食品”，深受日本人民的喜爱。

目前，纳豆已成为盛行于日本、加拿大、美国和欧洲一些国家的一种保健食品，我国也有企业开始生产和销售。纳豆在发酵过程中，纳豆菌产生一种丝氨酸蛋白酶(纳豆激酶NattoKinase)，纳豆激酶最早于1987年由日本宫崎医科大学的须见洋行等发现。研究表明，纳豆激酶具有纤溶活性，可以治疗和预防血栓疾病。目前，关于纳豆菌的研究和应用主要集中在纳豆激酶的作用上。但是，作为保健食品的纳豆还具有多种保健功能，如溶血栓、抗肿瘤、降血压、抗菌等作用，可预防骨质疏松、提高蛋白质的消化率、抗氧化等。

理化特性^[2]

纳豆激酶是枯草芽孢杆菌代谢时产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，为单链多肽结构，无二硫键，溶于水，固态呈淡黄色或白色。纳豆激酶的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA)序列由275个氨基酸残基构成，其相对分子质量一般

为28000u。该酶N末端为丙氨酸，等电点pH为(8.6±0.3)。在室温下，该酶在pH值6.0～12.0的范围内具有很强的纤维蛋白水解能力，最适pH值为8，在酸性条件下会迅速失活。纳豆激酶酶活不易受反复冻融影响，温度达50℃以上时酶活性会逐渐丧失，超过60℃酶迅速失活，其最适温度为45℃。此外金属离子也会影响其活性，Hg能使它完全失活，Mn2+、Zn>、Co斗、Cu2+和Mg2+等对其酶活也有抑制作用，而Ca斗和Mg对酶活有明显的激活作用。

作用机理^[3]

血栓是由血小板和纤维蛋白聚集形成的。有效的血栓溶解剂能切开血栓上纤维蛋白凝块，如纤溶酶。纳豆激酶属于枯草牙胞杆菌丝氨酸蛋白酶，其溶血栓活性是纤溶酶的4倍加，但其加速纤维蛋白溶解的机制还不十分明确。研究显示纳豆激酶可在体外将血栓水解，间接的将血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，使纤维蛋白凝块水解。

与阿替普酶、尿激酶、链激酶不同的是，纳豆激酶并没有血纤维蛋白溶酶原激活剂的功能，不能直接将血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶。纳豆激酶通过剪切使纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogenadivatorinhibitor，PAI)失活，而PAl的作用主要是抑制组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)。一般认为纳豆激酶是通过蛋白水解作用直接溶解纤维蛋白凝块的。

应用^[2]

1. 纳豆激酶药品

现在溶栓药物大多为纤溶酶原激活剂(plasminogenactivator，PA)或其类似物，可直接或间接激活纤溶酶原(plasminogen，Pg)变成纤溶酶(plasmin，Pm)，从而促进机体血栓的溶解。

由溶血栓药物的发展历程，可将其分为四代：代以UK和SK为代表，溶血栓效果好，但会出现系统性出血及过敏反应；第二代药物以tPA、葡激酶(straphylokinase，SaK)和NK为代表，与血栓基质有特异亲和力，但是半衰期长，单疗程用量较大；第三代药物以瑞替普酶(reteplase，rPA)、兰替普酶(1anoteplase，NPA)、靶向溶栓剂等为代表，对溶栓效率、特异性等进行了进一步的提升；第四代药物主要是纤溶酶原激活剂抑制剂.

(PAI.1)，通过增加血浆中tPA的浓度，促进溶栓活性，且可口服、价格较低。目前由于多种原因的限制，国内临床用药仍以UK和SK为主，根据当前情况，在第三、四代药物产品还在缓慢进行的时候，更应该务实的对第二代药物，尤其是纳豆激酶产品的深入开发。因纳豆激酶稳定性易受胃酸影响，令酶活力降低，所以应研发抗酸性更强的肠溶型制剂药物。

2. 纳豆激酶保健品

目前，纳豆激酶类保健品主要可分为胶囊剂和片剂两种，还有个别的颗粒剂。已有10余家大公司生产纳豆激酶类保健品，其中日本生物科研所最早将纳豆激酶投入商业化生产，美国、韩国、台湾地区相继也有大量的纳豆激酶生产厂家。在国家食品药品监督进口保健食品数据库中，并未查到任何国外纳豆激酶类保健食品的批准文号。

因此，国外的纳豆激酶类保健食品数年内还不能进入中国市场，对国内产品暂时不会构成威胁。这也显示出了国内对NK没有形成完善、统一、严格的纳豆激酶类保健食品成分标准，缺乏明确的功能指标和感觉评价体系。其次，国内纳豆激酶保健品多以黄豆为主要原料，功能过于单一、发酵活性较低，不利于高活性产品的制备。

3. 功能性食品

纳豆作为一种与纳豆激酶相关的功能性食品，与现有的临床溶栓药物相比具有许多优点，如安全性好、成本低、疗效久和有效预防血栓产生。纳豆含有大豆的各种营养成分，且营养物质的含量均高于蒸煮的大豆。在其制作中，微生物酶系将大豆蛋白质分解为氨基酸和多肽，蛋白质的消化率由65％提高至80％，更有利于吸收。

此外，纳豆还具有抗菌、抗肿瘤、防治骨质疏松、溶解血栓等功能。据统计约90％的日本人将新鲜纳豆作为日常必需食品，还将其列入中小学生营养配餐。在我国，鲜纳豆由于其令人不愉快的臭味不易被消费者接受，这大大阻碍了通过饮食摄入纳豆激酶，降低血栓发病率的措施。

因此需开发适合国内消费者口味的纳豆产品，目前通过从传统发酵食品中分离出产纳豆激酶生产菌株，或者将纳豆食品胶囊化来掩盖纳豆的臭味，来解纳豆口感不适问题。在原有纳豆食品的研究基础上，许多科研人员也将纳豆激酶运用到其他的食品中，如将纳豆激酶作为外源性水解蛋白酶去促进奶酪中的原发性蛋白水解，此过程不仅增加了大部分游离氨基酸的含量，而且这些氨基酸能用作许多分解代谢反应的底物，反过来又改善了奶酪的风味。

制备^[2]

1）发酵生产：纳豆激酶是微生物代谢产物，只要工程菌活性稳定，工艺成熟即可实现大规模生产。由于NK发酵原料来源广、生产周期短、产量高、价格低廉和易于提取纯化等优势，使其开发前景广。与液体发酵相比，固态发酵成本低、酶活力高、酶系丰富、设备操作简单、易于企业扩大化生产且产率高，因此，国内外食品发酵工业化生产普遍采用这种工艺。

发酵后的产品不仅可用作食品直接食用，还可以通过进一步的分离纯化，制得不同级别的纳豆激酶产品一纳豆胶囊和纳豆激酶胶囊。目前商业化发酵中采用的纳豆激酶，活性为800~4000IU/g。纳豆激酶发酵基质以含水量在50％~70％之间的黄豆为主。此外可通过添加麦芽糖及少量的无机盐，促进纳豆激酶的合成，提高纳豆激酶的含量，或以农副产品为原料降低发酵的成本。纳豆激酶拥有现在市场上的一些溶栓药物所无法比拟的优势，因此专家学者期望利用它开发为新一代的溶栓剂。

国内外有关筛选产纳豆激酶菌株酶活力的报道多数为100~3000IU/g，少部分较高纳豆激酶酶活力的报道为3000-5000IU/mL。就目前纳豆激酶酶活力不足的研究现状，提高纳豆激酶酶活力对开发新型溶栓药物非常关键。提升纳豆激酶产量常用的方法有：对野生菌种进行大量筛选或诱变，以期得到产酶量高的菌种；优化发酵条件，包括对发酵原料和发酵因素的优化；利用基因工程技术，改造菌种的基因，得到产酶量高的菌种。

2）纳豆激酶的纯化

目前纯化纳豆激酶常用的方法有：盐析、超滤、层析过滤以及凝胶过滤。其中将发酵液通过硫酸铵沉淀和SephadexG.50凝胶过滤层析进行分离纯化，得到酶比活力、纯化倍数、酶活回收率分别为22388.81U/mg、19倍和42.1％的高纯度纳豆激酶。采用硫酸铵沉淀和PhenylSepharose疏水柱层析分离纯化纳豆激酶NKII粗酶液，得到酶活回收率、纯化倍数、比活力分别为56.51％、17.90倍和48407.77 IU/mg的高纯度纳豆激酶。

通过采用硫酸铵沉淀、超滤浓缩和阴离子交换层析的方法对冬虫夏草中的粗酶进行分离纯化，得到纯化倍数高达86.1倍，回收率为13.7％的纳豆激酶。这些研究大都存在着方法繁琐、回收率较低、不利于保持酶活力和规模化生产等问题。随着现代分离技术的发展，分离技术在发酵产品分离纯化中应用日渐广泛，把新型分离技术应用于纳豆激酶的分离纯化，对科学研究及生产意义重大。

主要参考资料

[1] 生物防腐剂

[2] 纳豆激酶的研究进展与展望

[3] 纳豆激酶研究进展