纳豆激酶的分离纯化方法和制备方法

背景及概述^[1-2]

1987年须见洋行在日本的传统发酵食品纳豆中发现了一种具有强烈纤溶活性的酶，定名为纳豆激酶(Nattokinase，NK)。研究表明，纳豆激酶是一种丝氨酶蛋白酶(丝氨酸蛋白酶)，能显著溶解体内外血栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间(Euglobulinlysistime，ELT)，并能刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂(t-PA)，从而更有效地发挥溶栓效果。因此纳豆激酶是一种很有潜力的新型口服溶栓药物。

分离纯化方法^[1]

(1)纳豆激酶发酵液的制备

从固体培养基上挑取纳豆激酶的单菌落接入20mL的种子培养基中，摇床中培养12h，按2％接种量接入发酵液体培养基中，在25℃下发酵罐培养36h。液体发酵结束后，通过离心除去菌体，得到纳豆激酶发酵液。

(2)亲和配基在磁性微球上的固定化

将自制的磁性聚甲基丙烯酸甲酯微球进行表面功能化修饰得到表面含有环氧功能基团的磁性微球。在60℃条件下，以氢氧化钠为催化剂，以氨基苯甲脒作为亲和配基，在磁性微球的表面进行固定化反应，获得表面含有苯甲脒的磁性微球。

(3)采用磁性微球从发酵液中分离纳豆激酶

将表面含有苯甲脒的磁性微球加入到纳豆激酶的发酵液中，在室温下缓慢搅拌充分混合30分钟，使纳豆激酶特异性地吸附在磁性微球表面。采用磁铁将吸附有纳豆激酶的磁性微球从发酵液中分离出来，用Tris-HCl溶液清洗一次去除杂质，再用甘氨酸一盐酸(pH3.3)进行解析，收集到纳豆激酶的洗脱液，洗脱液保存在10℃条件下。采用纤维蛋白水解法测定分离后纳豆激酶的活力为80％，纯化因子为6.0。

制备^[2]

1)发酵

从固体培养基挑取表达纳豆激酶的单菌落接入10毫升的种子培养基中，150转/分钟(rpm)下摇床培养8小时，按1％接种量接入发酵培养基中，再于28℃、150转/分钟下发酵罐培养100小时。发酵过程中，纳豆激酶会从纳豆菌中释放出来，液体中含有纳豆激酶及菌体。

2)细胞破碎

如上所述，在发酵过程中，纳豆激酶会从纳豆菌中释放出来。经研究表明，发酵只能释放出纳豆菌中所含有的部分纳豆激酶，约有50％左右的纳豆激酶受到纳豆菌细胞的细胞壁的阻碍，会卡在纳豆菌细胞的细胞壁而未能从纳豆菌细胞中释放出来，因此现有技术纳豆激酶的制造方法无法利用卡在纳豆菌细胞壁的纳豆激酶，因此，总是无法达到理想的回收率。

为解决此问题，本发明提供了细胞破碎的步骤，即将纳豆菌细胞的细胞壁破碎。将细胞壁破碎后，可以将先前技术中被卡在纳豆菌细胞壁的纳豆激酶均释放出来，因此，可较大程度上提升纳豆激酶的回收率。

瞬间(一般为1秒以内)改变发酵液所处环境的压力，例如，可瞬间提升至2000磅/平方英寸(Psi)再瞬间降至常压，以使纳豆菌细胞壁破碎，此步骤重复进行，以使纳豆菌细胞充分破碎。

3)离心

用冷冻离心机将发酵液于0℃下以2000转/分钟(rpm)的速度离心8分钟，收集上清液，于上清液中加入10％饱和度的硫酸铵(NH4)2SO4沉淀，2000转/分钟离心收集上清液，继续在上清液中加入硫酸铵至60％的饱和度，2000转/分钟离心收集沉淀，将沉淀重悬于10毫摩尔浓度、pH值为6的磷酸缓冲液中，2000转/分钟离心10分钟收集上清液，于0℃保存备用。

4)精制，即纯化

用层析系统将上清液以10公分/小时(cm/h)的线速度加入凝胶层析柱中，用10毫摩尔浓度(mM)的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪于波长为280纳米和260纳米进行检测，收集保留体积为9毫升处的洗脱液，收集液体积为3毫升，此步骤可称作凝胶层析分离。

5)制成高纯度纳豆激酶产品

将精制步骤中收集得到的洗脱液放置于去离子水中进行透析脱盐16小时后，置于-20℃冰箱下冷冻12小时将其进行冷冻干燥，干燥时间为24小时，即可得到高纯度的纳豆激酶产品。

参考文献

[1][中国发明]CN200510075057.9一种磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法

[2][中国发明]CN200610109112.6纳豆激酶的制造方法