AGL1 Electro感受态细胞

背景^[1-7]

AGL1 Electro感受态细胞是以为C58,RecA型背景，核基因中含有筛选标签—利福平抗性基因rif和羧苄青霉素抗性基因carb，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pTiBo542DT-DNA，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pTiBo542DT-DNA质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。

AGL1菌株适用于水稻、拟南芥、杨树等植物的转基因操作。唯地生物开发的AGL1电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pCAMBIA2301质粒(size:11633bp)检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pCAMBIA2301-ZH质粒(size:40kd)检测转化效率可达5×103 cfu/μg DNA。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour inducing)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。

选择一种特制的空质粒载体（如PBI121质粒载体），其上要求含有T-DNA边界序列（此处可参见词条双元表达载体系统），在序列之间含有复制原点、抗性基因、GUS报告基因、HindⅢ和BamH I等酶切位点（以上这些构成了一个T-DNA区）。先通过双酶切反应酶切空质粒载体和目的基因，再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因，从而构建成完整的重组质粒。

此时重组质粒的T-DNA区包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。我们称这段T-DNA区为目的片段。农杆菌转化法的原理是构建双元表达载体系统，由两种质粒组成，一种是位于大肠杆菌中的穿梭质粒，另一种是位于农杆菌中的辅助性质粒。将重组质粒电转化到农杆菌感受态细胞中后，用含有重组质粒的农杆菌去侵染植物根部切口，通过辅助性质粒的Vir区表达蛋白与重组质粒T-DNA区（目的片段）的反式作用激活T-DNA的转移（此处可参见词条双元表达载体系统），从而将目的片段整合到植物细胞基因组中。随着愈伤组织的形成，使得新生细胞均含有该目的片段的基因。

应用^[7][8]

AGL1 Electro感受态细胞可用于DNA插入突变及生长代谢突变子分析的研究：

瑞氏木霉(Trichoderma reesei，anamorph；Hypocrea jecorina)是具有重要经济价值的工业丝状真菌，可以用于生产纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶以及蛋白酶等多种酶类，这些酶类已广泛应用于纺织、造纸、制浆等工业领域。同时，由于具有很强的蛋白分泌能力，该菌已被开发成为表达同源蛋白和异源蛋白的良好真核宿主。多样化的代谢能力、对人没有毒性以及生长快、无性繁殖等竞争性生长是瑞氏木霉的重要特征。

目前，瑞氏木霉全基因组测序工作已经完成，这对深入了解这个经济重要的工业菌株具有重大意义，同时也为鉴定那些与该菌生长、代谢相关的关键基因提供了良好平台。利用分子标签技术获得突变体己成为进行基因克隆和遗传学分析最有效的方法之一。因此，建立瑞氏木霉基因标签的插入突变体库是功能基因组学发展的趋势，而对不同表型突变体的正、反向遗传学分析可以促进揭示瑞氏木霉生长、代谢的分子机理。

研究的目的在于建立和优化根癌农杆菌介导的瑞氏木霉转化系统，利用T-DNA随机插入突变建立瑞氏木霉的突变体库；采用反向遗传学和正向遗传学方法相结合的策略对突变株进行变异性状的分析和基因水平的研究，鉴定那些与突变性状相关的新基因；选择那些控制瑞氏木霉生长、发育或重要代谢途径的关键基因发生插入突变的突变株进行生理、生化和分子遗传学的研究，深入了解基因的功能和阐明相关的分子机理。

1．农杆菌介导的瑞氏木霉转化及T-DNA插入突变分析本文用农杆菌AGL1成功介导转化了丝状真菌瑞氏木霉QM9414，T-DNA随机插入到瑞氏木霉染色体中，并得到了一批瑞氏木霉T-DNA插入突变体。将pAN7-1质粒的HPH基因表达盒插入到Ti质粒pBI121中，获得了双元载体pBI-hph。该载体导入农杆菌AGL1后，在乙酰丁香酮的诱导下，瑞氏木霉原生质体或孢子与农杆菌共培养产生了具有潮霉素抗性的转化子，转化效率较高，并筛选到了稳定的转化子。

从随机挑选的9个转化子的PCR和杂交分子验证表明，T-DNA上的HPH基因已插入到瑞氏木霉染色体中。借助于TAIL-PCR方法，从转化子中成功克隆到了T-DNA插入位点侧翼序列，序列分析证明T-DNA是随机插入到瑞氏木霉染色体中的。

参考文献

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