GV3101(pSoup)Electro感受态细胞

背景^[1-6]

GV3101(pSoup)Electro感受态细胞是以为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。

pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti质粒含有筛选标签：gent，赋予GV3101菌株庆大霉素抗性；在GV3101菌株中转入help质粒：pSoup即为GV3101(pSoup)菌株，可帮助pGreen，62SK，pGs2系列质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tet）抗性。适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。唯地生物开发的GV3101(pSoup)电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pGs2(卡那霉素抗性)质粒检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pGs2-ZH(卡那霉素抗性)质粒(size:40 kd)检测转化效率可达5×103 cfu/μg DNA。

GV3101(pSoup)Electro感受态细胞操作方法

1.0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入1-5μg质粒DNA（质粒体积不大于6ul，用试剂盒抽提，双蒸水溶解），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。

3.启动电转仪，设置参数：C=25μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。

4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天

注意事项：如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况，是可以用来转化的，但是由于冻存时间过长，转化效率会有所下降，如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的，如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。

应用^[7][8]

GV3101(pSoup)Electro感受态细胞可用于组织遗传转化体系建立的研究：

以农杆菌菌株GV3101和LBA4404、质粒pCAMBIA1301、牡丹品种’凤丹白’试管苗叶柄诱导形成的愈伤组织为供试材料,进行了农杆菌表达载体的转化和牡丹愈伤组织遗传转化体系的初步研究。试验获得了转化农杆菌GV3101和LBA4404,进一步将GUS基因转入牡丹愈伤组织,于共培养后成功检测到GUS瞬时表达活性。同时对经筛选培养后得到的转化愈伤组织进行了GUS组织化学检测,成功检测到GUS活性的表达。

主要结果及结论如下:1农杆菌表达载体的转化及菌株的筛选试验进行了质粒pCAMBIA1301 DNA的提取、农杆菌GV3101和LBA4404感受态的制备、质粒DNA对农杆菌的转化等一系列工作,成功的将质粒pCAMBIA1301转入农杆菌中,获得了含有GUS标记基因的农杆菌GV3101和LBA4404的表达载体。通过两个菌株侵染牡丹愈伤组织的一系列试验,结果表明,菌种GV3101自身毒性较强,抑菌较为困难,侵染愈伤后对牡丹愈伤生活力伤害较大,GUS组织化学染色后愈伤开始变红,且染色时间较长。

LBA4404属于弱毒性菌种,侵染后对牡丹愈伤生活力没有明显影响,且有较高的转化效率。因此确定菌株LBA4404为适宜牡丹愈伤组织遗传转化的菌种。2选择性抗生素的确定试验对常用的选择性抗生素Kan和Hyg进行筛选,分别试验牡丹愈伤组织对其的敏感性。牡丹愈伤组织遗传转化体系的初步构建本试验通过农杆菌介导的方法,最终选用农杆菌菌株LBA4404对牡丹愈伤组织遗传转化体系进行初步的研究。

对遗传转化过程中影响转化率的各项影响因子(预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间及温度等)的最适条件进行了初步筛选,并初步建立以细菌的植物组织培养基悬浮液侵染法的牡丹愈伤组织遗传转化体系:挑取LBA4404单菌落于YEB液体培养基中,置于摇床28℃环境中220rpm振荡培养过夜,将菌液室温4000rpm离心10min,弃上清,用植物液体培养基W0重悬菌体至OD600=0.6。

将继代后的牡丹愈伤组织切至0.2X 0.2cm大小,不经过预培养,直接用OD600=0.6的菌液侵染20min,将侵染后的愈伤置于滤纸上晾干后,接入共培养培养基,在22℃黑暗环境下共培养3d。随后用200mg·l-1Cef水涮洗浸泡愈伤30min,尽量洗净残留菌体,后接入含有100mg·I-1Cef的液体增殖培养基,振荡培养24h,随后将愈伤取出,经无菌水涮洗后置于滤纸上晾干,接至含有1OOmg·l-1Cef和3mg·l-1Hyg的固体筛选培养基中,20d转接一次。

参考文献

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[8]申萍.牡丹愈伤组织遗传转化体系建立的初步研究[D].河南农业大学,2014.