T5核酸外切酶的制备

背景及概述^[1]

核酸外切酶(exonucleautomotive service engineers)在核酸水解酶中，是具有从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶，总对单一核苷酸链作用，在剪切修饰反应中起作用，与核酸内切酶相对应。可大致分为水解磷酸二酯键的3′端生成5′-单核苷酸的酶，及水解5′端生成3′-单核苷酸的酶。前者有蛇毒磷酸二酯酶及大肠杆菌核酸外切酶I、II和III等；后者有脾脏磷酸二酯酶、嗜酸乳杆菌(Lac-tobacillus acidophilus) 核酸酶。这些酶中还可以区别出从分子链的3′末端或5′末端开始切断和对单链DNA或双链 DNA具有特异作用的酶。可利用这些酶水解方式的差异来分析核酸结构。

T5核酸外切酶纯化自含T5噬菌体D15基因质粒的E.coli菌株，是核酸外切酶的一种，该酶能沿5′→3′方向降解DNA。它既能从5′末端起始消化，也能从线性或环状双链DNA的切刻或缺口处起始消化，但不能降解超螺旋双链DNA。T5核酸外切酶还具有单链DNA核酸内切酶活性。这些特性使得T5核酸外切酶常被用于消化DNA和基因克隆上。随着基因克隆技术的普及，T5核酸外切酶市场需求量越来越大，而天然T5核酸外切酶的提取技术复杂、成本高、产率低。

制备^[1]

通过载体构建将密码子优化的T5核酸外切酶基因克隆到 pGEX载体中，在低温条件下通过与GST融合表达，来提高蛋白表达量和可溶性；T5核酸外切酶基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示；T5核酸外切酶与GST在宿主菌中融合表达，融合表达蛋白为GST-T5 Exonuclease；融合表达蛋白含有GST标签，用GST柱子纯化融合蛋白。图1A是重组表达载体pGEX-T5核酸外切酶的质粒图谱。

下述实验中的实验方法，如果无特殊说明， 均属于常规方法。

1、重组T5核酸外切酶原核表达载体pGEX-T5核酸外切酶的构建：

以合成T5核酸外切酶基因为模板，用PCR的方法扩增T5核酸外切酶编码序列，

所用的正向引物为：

5’-CATGGGATCCGACGACGACGACAAGATGAGCAAATCGTGGGGGAAATTCAT-3’，

反向引物为：5’-CATGCTCGAGTCACTGTTCTGCAATTTCGA-3’；

在正向引物中有一个BamH I的酶切位点以及编码肠激酶识别位点DDDDK的序列，反 向引物中有一个Xho I的酶切位点。PCR反应的条件为：94℃热变性一分钟，55℃退火一分 钟，72℃延伸90秒，共进行25个循环。pGEX和纯化的PCR产物采用BamH I和Xho I进 行双酶切，然后将PCR酶切片段回收插入pGEX的多克隆位点。pGEX是一个在N端融合 GST-tag的原核表达载体。对重组表达载体pGEX-T5核酸外切酶进行DNA测序，分析其阅读 框和编码序列的正确性。

按照方法中所述的步骤，将密码子优化的T5核酸外切酶基因克隆至GST编码序列的下 游并与之处于同一阅读框，为了便于释放并纯化野生型的T5核酸外切酶，本发明在GST-tag 和T5核酸外切酶基因之间设计并加入肠激酶的酶切位点，重组质粒经测序验证，成功构建了 融合蛋白pGEX-T5核酸外切酶的原核表达载体，阅读框及DNA序列全部正确，其简图参见图 1A。

2.pGEX-T5核酸外切酶的表达：

将T5核酸外切酶融合蛋白表达载体pGEX-T5核酸外切酶转入表达宿主菌E.coli  BL21(DE3)，挑取单克隆接种至新鲜的LB液体培养基(含50mg/l的氨苄青霉素)。待细菌长 至OD600为0.6左右，加入终浓度为0.4mM的IPTG诱导T5核酸外切酶的表达。

16℃诱导 12个小时后收集菌体，处理后的菌体蛋白样品跑12％SDS-PAGE，使用UVP white/ultraviolet  transilluminator对考马斯亮兰染色的凝胶进行扫描记录，采用专业分析软件Grab-it 2.5和 Gelwork分析目的蛋白占菌体总蛋白的比例。本文中，可溶性定义为：可溶性的目的蛋白/总 的目的蛋白×100％。在IPTG诱导后，出现了一条约为64kD的蛋白条带，和理论分子量大小 吻合，经凝胶扫描灰度分析，T5核酸外切酶融合蛋白约占菌体总蛋白的15％左右(图1B)，

3、蛋白的纯化

收集一升发酵液的细胞，并用40ml冰浴的bufferA(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，0.5％  Triton-X100，10％甘油，pH8.0重悬，超声裂解细胞，离心取上清，上清通过buffer A预平衡 的GST亲和柱，上样完毕用buffer A充分洗涤至基线，而后用buffer B(50mM Tris-HCl，20mM  Reduced Glutathione，10％甘油，pH8.0)洗脱目的蛋白。

将结合了GST-T5核酸外切酶透析后用EK酶切，按照EK(mg)∶目标蛋白(mg)＝1∶10000 的比例将EK加入融合蛋白溶液中开始酶切反应，酶切条件为4℃，16小时，酶切溶液通过 GST亲和柱收集流出液，流出液进一步经强阴离子交换吸附层析Q-Sepharose纯化。纯化后 的酶采用Micro BCA试剂盒定量及凝胶灰度扫描分析。

通过GST亲和层析、EK酶切以及离子交换层析纯化，得到了野生型的不带任何亲和标 签的T5核酸外切酶。GST亲和层析去除了绝大部分菌体杂蛋白，用肠激酶酶切，将不带任何 冗余氨基酸的T5核酸外切酶与GST标签分离开，最后通过离子交换层析去除EK和痕量的 DNA，最终从一升发酵液中得到了约8mg的野生型T5核酸外切酶(纯度约95％)。12％ SDS-PAGE分析表明，纯化的T5核酸外切酶与理论分子量31.6kD相符(图2B)。

4.T5核酸外切酶的活性检测方法

1单位T5核酸外切酶指在50μl反应体系，37℃反应30分钟，能从双链DNA底物上催化产生1nmol的酸可溶性脱氧核糖核苷酸所需要的酶量。

主要参考资料

[1] CN201410382116.6 一种T5核酸外切酶在大肠杆菌中的制备方法